S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Introduzione
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - l'agente eziologico della peronospora, la malattia economicamente più importante di patate e pomodori - ha attirato l'attenzione di ricercatori di diversi paesi per più di un secolo e mezzo. Apparso all'improvviso in Europa a metà del XIX secolo, ha causato un'epidemia di patate che è rimasta nella memoria di molte generazioni.
Fino ad ora è spesso chiamato il "fungo della fame irlandese". Quasi cento anni dopo le prime epidemie, furono scoperte specie di patate selvatiche messicane resistenti alla peronospora, furono sviluppati metodi per incrociarle con patate coltivate (Muller, 1935) e furono ottenute le prime varietà resistenti alla peronospora (Pushkarev, 1937). Tuttavia, subito dopo l'inizio della loro coltivazione commerciale, si accumularono razze dell'agente patogeno della peronospora virulenta rispetto alle varietà resistenti. e l'introduzione di nuovi geni di resistenza dalle patate selvatiche messicane nelle varietà iniziò a perdere rapidamente efficacia.
I fallimenti con l'uso della resistenza monogenica (verticale) hanno costretto gli allevatori a cercare modi più complessi per sfruttare la resistenza poligenica (orizzontale) aspecifica. Negli ultimi anni, razze altamente aggressive hanno cominciato ad accumularsi nelle singole popolazioni del parassita, provocando un'erosione di resistenza anche aspecifica. L'avvento di ceppi resistenti ai fungicidi ha causato problemi nell'uso di prodotti chimici per la protezione delle patate.
A causa delle significative differenze tra oomiceti e funghi nella composizione chimica, nell'ultrastruttura e nel metabolismo, i fungicidi, specialmente quelli sistemici usati per proteggere le piante da molte malattie fungine, sono inefficaci contro gli oomiceti.
Pertanto, nella protezione chimica contro la peronospora, è stata utilizzata la spruzzatura multipla (fino a 12 volte per stagione o più) con agenti di contatto di un ampio spettro di azione. Un passo rivoluzionario è stato l'uso delle fenilammidi, che sono tossiche per gli oomiceti e si diffondono sistematicamente nelle piante. Tuttavia, il loro uso diffuso ha portato rapidamente all'accumulo di ceppi resistenti nelle popolazioni fungine (Davidse et al., 1981), il che ha complicato significativamente la protezione delle piante. P. infestans è praticamente l'unico parassita della zona temperata, il cui danno nell'agricoltura biologica non può essere neutralizzato senza l'uso di mezzi chimici di protezione (Van Bruggen, 1995).
Quanto sopra spiega la grande attenzione che ricercatori di diversi paesi prestano allo studio delle popolazioni di P. infestans, le dinamiche della loro abbondanza e composizione genetica, nonché i meccanismi genetici di variabilità.
Ciclo di vita di R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans sviluppa un micelio intercellulare con haustoria all'interno delle foglie di patata. Nutrendosi dei tessuti della foglia, provoca la formazione di macchie scure, che diventano nere e marciscono in caso di pioggia. Con una forte sconfitta, l'intera foglia muore. Dopo un periodo di alimentazione, si formano escrescenze sul micelio - sporangiofori - che crescono verso l'esterno attraverso gli stomi. In caso di pioggia, formano una fioritura bianca attorno alle macchie sul lato inferiore delle foglie. Alle estremità degli sporangiofori si formano zoosporangi a forma di limone, che si staccano e vengono trasportati da spruzzi di pioggia (Fig.1). Cadendo in gocce d'acqua sulla superficie di una foglia di patata, gli sporangi germinano con 6-8 zoospore che, dopo un periodo di movimento, si arrotondano, si ricoprono di un guscio e germinano con un tubo di germoglio. Il germoglio penetra attraverso gli stomi nel tessuto fogliare. In determinate condizioni, gli sporangi possono crescere in un tubo di crescita direttamente nel tessuto fogliare. In condizioni favorevoli, il tempo dall'infezione alla formazione di nuova sporulazione è di soli 3-4 giorni.
Una volta a terra e filtrati attraverso il terreno, gli sporangi sono in grado di infettare i tuberi. I tuberi gravemente colpiti marciscono durante la conservazione; nei soggetti deboli l'infezione può persistere fino alla stagione successiva. Inoltre, l'agente eziologico della peronospora può persistere in inverno sotto forma di oospore (spore sessuali a riposo a pareti spesse) nel terreno sui detriti delle piante e sui semi di pomodoro. Le oospore si formano sugli organi vegetali viventi quando ceppi di diversi tipi di accoppiamento incontrano un'umidità eccessiva. In primavera si forma la sporulazione asessuata sui tuberi infetti piantati e sui residui vegetali con oospore; le zoospore entrano nel terreno e causano l'infezione delle foglie inferiori delle piante. In alcuni casi, il micelio può crescere dal tubero infetto lungo la parte verde della pianta e di solito compare nella parte superiore del fusto.
Una differenza significativa tra gli oomiceti e la maggior parte dei funghi risiede nella predominanza della diplofase nel loro ciclo vitale con meiosi gametica e germinazione di zigoti (oospore) senza fissione nucleare riduttiva. Questa caratteristica, unita all'eterotallismo dipolare che sostituisce la bisessualità, sembrerebbe consentire di applicare agli oomiceti gli approcci sviluppati per lo studio delle popolazioni di eucarioti superiori (analisi della panmixia e suddivisione delle popolazioni, flussi genici intra e interpopolativi, ecc.). Tuttavia, tre fattori non consentono di trasferire completamente questi approcci allo studio delle popolazioni di P. infestans.
1. Insieme alle oospore ibride, nelle popolazioni si formano oospore autofertili e partenogenetiche (Fife e Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) e la frequenza della loro formazione può essere sufficiente per influenzare sui risultati del test.
2. Il processo sessuale in P. infestans contribuisce in modo insignificante alla dinamica della dimensione della popolazione, perché il fungo si riproduce principalmente per spore vegetative, formando per oltre il 90% dei risultati dell'analisi del tipo di accoppiamento con il metodo tradizionale su un mezzo nutritivo ... la stagione di crescita è costituita da diverse generazioni di sporulazione asessuata (sviluppo di malattie policicliche). Le oospore svolgono un ruolo importante nella conservazione dell'organismo durante il periodo in cui non sono presenti piante verdi (in inverno) e nell'infezione primaria delle piantine. Quindi, durante l'estate, si verifica la riproduzione clonale e un aumento o, al contrario, una diminuzione del numero di singoli cloni derivanti dalla ricombinazione sessuale, che è determinata principalmente dalla selezione dei più adattati. Pertanto, il rapporto tra i singoli cloni in una popolazione all'inizio e alla fine delle epifitiche può essere completamente diverso.
3. Il ciclo descritto è caratteristico delle popolazioni native di P. infestans nella loro patria, l'America centrale. In altre aree del mondo, il processo sessuale non era noto da più di 100 anni; il micelio vegetativo nei tuberi di patata infetti era la fase di svernamento. Il ciclo vitale era completamente agamico e la diffusione era di natura focale: l'infezione da singoli tuberi piantati infetti passava alle foglie, formando focolai primari della malattia, che potevano fondersi durante il massiccio sviluppo della malattia.
Pertanto, in alcune regioni potrebbe esserci un'alternanza di cicli sessuali e asessuali, mentre in altre - solo ciclo asessuale.
Origine di P. INFESTANS
P. infestans è apparso in Europa alla fine della prima metà del XIX secolo. Poiché la patata è originaria del Sud America nord-orientale, si presumeva che il parassita fosse stato portato da lì in Europa durante il boom del salnitro cileno. Tuttavia, gli studi condotti presso la stazione di patate del Rockefeller Center nella Valle di Toluca, in Messico, hanno costretto questo punto di vista a essere riconsiderato (Niederhauser, 1991, 1993).
1. Nella Valle di Toluca, le specie di patate tuberose locali (Solanum demissum, S. bulbocastanum, ecc.) Hanno diversi set di geni per la resistenza verticale combinati con un alto livello di resistenza aspecifica, che indica una lunga coevoluzione con il parassita. Le specie sudamericane, comprese le patate coltivate, mancano di geni di resistenza.
2. Nella Valle di Toluca si trovano isolati con accoppiamento di tipo A1 e A2, per cui è diffusa la popolazione ibrida di P. infestans; mentre nella patria delle patate coltivate, in Sud America, il parassita si diffonde clonalmente.
3. Nella Valle di Toluca si verificano annualmente gravi epidemie di peronospora. Pertanto, tra i ricercatori nordamericani (Cornell University), si afferma l'opinione sulla Mesoamerica (America Centrale) come luogo di nascita della phytophthora di patate (Goodwin et al., 1994).
I ricercatori sudamericani non condividono questa opinione. Credono che la patata coltivata e il suo parassita P. infestans abbiano una patria comune: le Ande sudamericane. Hanno supportato il loro punto di vista mediante studi molecolari sull'analisi dei polimorfismi del DNA del genoma mitocondriale (mtDNA) e dei geni nucleari RAS e β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Hanno dimostrato che i ceppi raccolti da diverse parti del mondo discendono da tre linee ancestrali divergenti che (tutte e tre) si trovano nelle Ande sudamericane. Gli aplotipi andini discendono da due linee: gli isolati della più antica stirpe mtDNA si trovano sulle Solanacee selvatiche dalla sezione Anarrhicomenum in Ecuador, mentre gli isolati della seconda linea sono comuni su patate, pomodori e belladonne selvatiche. A Toluca, anche gli aplotipi rari discendono da un solo lignaggio, con la variabilità genetica dei ceppi di Toluca (bassa frequenza allelica di alcuni siti variabili) suggerisce un forte effetto fondatore dovuto alla recente deriva.
Inoltre, nelle Ande è stata trovata una nuova specie P. andina, morfologicamente e geneticamente simile a P. infestans, che, secondo gli autori, indica nelle Ande un punto caldo di speciazione nel genere Phytophthora. Infine, in Europa e negli Stati Uniti, le popolazioni di P. infestans comprendono entrambe le linee andine, mentre a Toluca solo una.
Questa pubblicazione ha suscitato una risposta da parte di un gruppo di ricercatori di diversi paesi che hanno svolto molto lavoro sperimentale per rivedere lo studio precedente (Goss et al., 2014). In questo lavoro, in primo luogo, sono state utilizzate sequenze di DNA microsatellite più informative per studiare i polimorfismi del DNA; in secondo luogo, per l'analisi di clustering, percorsi migratori, tempo di divergenza delle popolazioni, ecc. sono stati utilizzati modelli più avanzati (statistica F, approssimazioni bayesiane, ecc.) e, in terzo luogo, è stato utilizzato un confronto non solo con la specie andina P. andina, in cui è stata stabilita una natura ibrida (P. infestans x Phytophthora sp.) ma anche con le specie endemiche messicane P. mirabilis, P. Ipomoeae e Phytophthora phaseoli, che sono P. infestans geneticamente vicine incluse nello stesso clade (Kroon et al., 2012). Come risultato di queste analisi, è stato dimostrato in modo inequivocabile che la parte radice dell'albero filogenetico di tutte le specie del genere Phytophthora prese nello studio, ad eccezione dell'ibrido P. andina, appartiene a ceppi messicani e il flusso migratorio ha la direzione Messico - Ande, e non viceversa, e il suo inizio coincide con quello europeo colonizzazione del Nuovo Mondo (300-600 anni fa). Pertanto, l'emergere della specie P. infestans, specializzata per la sconfitta delle patate, si è verificata nel centro genetico secondario della formazione delle solanacee tuberose, ad es. in America centrale.
Genoma di P. INFESTANS
Nel 2009, un team internazionale di scienziati ha sequenziato il genoma completo di P infestans (Haas et al, 2009), la cui dimensione era di 240 MB. Questo è molte volte di più rispetto alle specie strettamente imparentate P. sojae (95 Mb), che causano marciumi radicali dei semi di soia, e P. Ramorum (65 Mb), che colpiscono specie arboree preziose come la quercia, il faggio e alcune altre. I dati ottenuti hanno mostrato che il genoma contiene un gran numero di copie di sequenze ripetute - 74%. Il genoma contiene 17797 geni codificanti proteine, la maggior parte dei quali sono geni coinvolti nei processi cellulari, tra cui la replicazione del DNA, la trascrizione e la traduzione delle proteine.
Un confronto dei genomi del genere Phytophthora ha rivelato un'organizzazione insolita del genoma, costituita da blocchi di sequenze di geni conservati, in cui la densità genica è relativamente alta e il contenuto di sequenze ripetute è relativamente basso, e singole regioni con sequenze geniche non conservate, con una bassa densità genica e un alto contenuto di regioni ripetute. I blocchi conservativi rappresentano il 70% (12440) di tutti i geni che codificano le proteine di P. infestans. All'interno di blocchi conservativi, i geni sono solitamente ravvicinati con una distanza intergenica media di 604 bp. Nelle aree tra i blocchi conservativi, la distanza intergenica è maggiore (3700 bp) a causa di un aumento della densità degli elementi ripetuti. I geni secretori effettori in rapida evoluzione si trovano in regioni povere di geni.
L'analisi di sequenza del genoma di P. Infestans ha mostrato che circa un terzo del genoma appartiene a elementi trasponibili. Il genoma di P. infestans contiene famiglie di trasposoni significativamente più diverse rispetto ad altri genomi noti. La maggior parte dei trasposoni di P. infestans appartiene alla famiglia Gypsy.
Nel genoma di P. infestans è stato identificato un gran numero di famiglie di geni specifici coinvolti nella patogenesi. Una parte significativa di essi codifica per proteine effettrici che modificano la fisiologia della pianta ospite e contribuiscono alla sua infezione. Si dividono in due grandi categorie: effettori apoplastici, che agiscono negli spazi intercellulari (apoplasti), e effettori citoplasmatici, che entrano nelle cellule attraverso l'austoria. Gli effettori apoplastici includono enzimi idrolitici secreti come proteasi, lipasi e glicosilasi che distruggono le cellule vegetali; inibitori degli enzimi di difesa della pianta ospite e tossine necrotizzanti come le proteine simili a Nep1 (NPL) e le piccole proteine ricche di cisteina (SCR) simili a Pcf.
I geni effettori di P. infestans sono numerosi e generalmente più grandi dei geni non patogeni. I più famosi sono gli effettori citoplasmatici RXLR e Crinkler (CNR). I tipici effettori citoplasmatici degli oomiceti sono le proteine RXLR. Tutti i geni effettori RXLR scoperti finora contengono il gruppo ammino-terminale Arg-XLeu-Arg, dove X è un amminoacido. Come risultato dello studio, è stato suggerito che ci sono 563 geni RXLR nel genoma di P. infestans, che è il 60% in più rispetto a P. sojae e P. ramorum. Circa la metà dei geni RXLR nel genoma di P. infestans sono specie-specifici. Gli effettori RXLR hanno un'ampia varietà di sequenze. Tra loro, sono state identificate una grande e 150 piccole famiglie. A differenza del proteoma principale, i geni effettori RXLR si trovano solitamente in regioni del genoma povere di geni e ricche di ripetizioni. Gli elementi mobili che determinano il dinamismo di queste regioni facilitano la ricombinazione in questi geni.
Gli effettori citoplasmatici CRN sono stati originariamente identificati nei trascritti di P. infestans che codificano per i peptidi di necrosi dei tessuti vegetali. Dalla loro scoperta, si sa poco della famiglia di questi effettori. L'analisi del genoma di P. Infestans ha rivelato un'enorme famiglia di 196 geni CRN, che è molto più grande di quella di P. sojae (100 CRN) e P. ramorum (19 CRN). Come gli RXLR, i CRN sono proteine modulari e sono costituiti da un dominio LFLAK N-terminale altamente conservato (50 amminoacidi) e da un dominio DWL adiacente contenente geni diversi. La maggior parte dei CRN (60%) possiede un peptide segnale.
È stata studiata la possibilità di vari CRN di interrompere i processi cellulari della pianta ospite. Durante l'analisi della necrosi delle piante, la rimozione delle proteine CRN2 ha permesso di identificare la regione C-terminale costituita da 234 aminoacidi (posizioni 173-407, dominio DXG) e che causa la morte cellulare. L'analisi dei geni di P. infestans CRN ha rivelato quattro diverse regioni C-terminali, che causano anche la morte cellulare all'interno della pianta. Questi includono i domini DC appena identificati (P. Infestans ha 18 geni e 49 pseudogeni), così come i domini D2 (14 e 43) e DBF (2 e 1) simili alle protein chinasi. Le proteine dei domini CRN espresse in una pianta vengono conservate (in assenza di peptidi segnale) in una cellula vegetale e stimolano la morte cellulare mediante un meccanismo intracellulare. Altre 255 sequenze contenenti domini CRN molto probabilmente non funzionano come geni.
L'aumento del numero e delle dimensioni delle famiglie di geni effettrici RXLR e CRN era presumibilmente dovuto alla ricombinazione omologa non allelica e alla duplicazione genica. Nonostante il fatto che il genoma contenga un gran numero di elementi mobili attivi, non ci sono ancora prove dirette del trasferimento dei geni effettori.
Metodi utilizzati nello studio della struttura della popolazione
Lo studio della struttura genetica delle popolazioni si basa attualmente sull'analisi di colture pure dei suoi ceppi costituenti. L'analisi delle popolazioni senza isolare colture pure viene effettuata anche per scopi specifici, come, ad esempio, lo studio dell'aggressività di una popolazione o della presenza di ceppi resistenti ai fungicidi in essa (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Questo tipo di ricerca prevede l'uso di metodi speciali, la cui descrizione va oltre lo scopo di questa revisione. Per l'analisi comparativa dei ceppi, vengono utilizzati numerosi metodi, basati sia sull'analisi della struttura del DNA che sullo studio delle manifestazioni fenotipiche. L'analisi comparativa delle popolazioni ha a che fare con un gran numero di isolati, il che impone determinati requisiti ai metodi utilizzati. Idealmente, dovrebbero soddisfare i seguenti requisiti (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- essere economico, facile da implementare, non richiedere un dispendio di tempo significativo, essere basato su tecnologie generalmente disponibili (ad esempio, PCR);
- deve generare un numero sufficientemente elevato di caratteristiche marcatori codominanti indipendenti;
- avere un'elevata riproducibilità;
- utilizzare la quantità minima di tessuto da esaminare;
- essere specifico per il substrato (la contaminazione presente nella coltura non dovrebbe influenzare i risultati);
- non richiedono l'uso di procedure pericolose e sostanze chimiche altamente tossiche.
Sfortunatamente, non esistono metodi corrispondenti a tutti i parametri precedenti. Per uno studio comparativo dei ceppi del nostro tempo, vengono utilizzati metodi basati sull'analisi dei tratti fenotipici: virulenza alle varietà di patate e pomodori (razze di patate e pomodori), tipo di accoppiamento, spettri degli isoenzimi della peptidasi e della glucosio-6-fosfato isomerasi e sull'analisi della struttura del DNA: polimorfismo della lunghezza frammento di restrizione (RFLP), che di solito è integrato con una sonda di ibridazione RG 57, analisi di ripetizioni di microsatelliti (SSR e InterSSR), amplificazione con primer casuali (RAPD), amplificazione di frammenti di restrizione (AFLP), amplificazione con primer omologhi alle sequenze di elementi mobili (ad esempio, Inter SINE PCR), determinazione degli aplotipi del DNA mitocondriale.
Brevi descrizioni dei metodi per lo studio comparativo dei ceppi utilizzati nel lavoro con P. Infestans
Tratti marker fenotipici
Gare di "patate"
Le razze "patate" sono un indicatore comunemente ricercato e utilizzato. Le razze "patate semplici" hanno un gene per la virulenza della patata, quelli "complessi" - almeno due. Black et al. (1953), riassumendo tutti i dati a loro disposizione, scoprirono che la razza phytophthora è in grado di infettare le piante con il gene / i geni di resistenza corrispondenti ai geni / geni di virulenza di P. infestans, e trovarono le razze 1, 2, 3 e 4 che infettano le piante con i geni R1, R2, R3 e R4, rispettivamente, ad es. l'interazione tra il parassita e l'ospite avviene secondo il principio gene per gene. Inoltre, Black, con la partecipazione di Gallegly e Malcolmson, scoprì i geni di resistenza R5, R6, R7, R8, R9, R10 e R11, così come le razze corrispondenti (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Esiste un ampio corpo di dati sulla composizione razziale dell'agente patogeno da diverse regioni. Senza analizzare questi dati in dettaglio, indicheremo solo una tendenza generale: dove sono state utilizzate varietà con nuovi geni di resistenza o loro combinazioni, all'inizio si è verificato un indebolimento della peronospora, ma poi sono apparse e selezionate razze con i corrispondenti geni di virulenza e sono stati ripresi focolai di peronospora. La virulenza specifica contro i primi 4 geni di resistenza (R1-R4) è stata osservata raramente nelle raccolte raccolte prima dell'introduzione in coltivazione di varietà con questi geni, ma il numero di ceppi virulenti è aumentato notevolmente quando il patogeno è stato parassitato su varietà portatrici di questi geni. I geni 5-11, d'altra parte, erano abbastanza comuni nelle raccolte (Shaw, 1991).
Uno studio del rapporto tra le diverse razze durante la stagione di crescita, condotto alla fine degli anni '1980, ha mostrato che all'inizio dello sviluppo della malattia predominano nella popolazione i cloni con bassa aggressività e 1-2 geni di virulenza.
Inoltre, con lo sviluppo della peronospora, la concentrazione dei cloni originali diminuisce e aumenta il numero di razze "complesse" con elevata aggressività. Il verificarsi di quest'ultimo entro la fine della stagione raggiunge il 100%. Quando si conservano i tuberi, si verifica una diminuzione dell'aggressività e la perdita dei singoli geni di virulenza. La dinamica della sostituzione del clone può avvenire in diverse varietà in modi diversi (Rybakova & Dyakov, 1990). Tuttavia, i nostri studi nel 2000-2010 hanno mostrato che le razze complesse si trovano fin dall'inizio degli epifitotici tra i ceppi isolati sia dalle patate che dai pomodori. Ciò è probabilmente dovuto a un cambiamento nelle popolazioni di P. Infestans in Russia.
Nel 1988-1995, la presenza di "superrazze" con tutti o quasi tutti i geni di virulenza in varie regioni ha raggiunto il 70-100%. Questa situazione è stata osservata, ad esempio, in Bielorussia, nelle regioni di Leningrado e Mosca, nell'Ossezia settentrionale e in Germania (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Gare di "pomodoro"
Nelle cultivar di pomodoro, sono stati trovati solo 2 geni di resistenza alla peronospora: Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) e Ph2 (Al-Kherb, 1988). Come nel caso delle razze di patate, l'interazione tra pomodori e P. infestans avviene gene per gene. La razza T0 infetta varietà che non hanno geni di resistenza (la maggior parte delle varietà utilizzate industrialmente), la razza T1 infetta varietà con il gene Ph1 (Ottawa) e la razza T2 infetta varietà con il gene Ph2.
In Russia, quasi esclusivamente T0 è stato trovato sulle patate; Il T0 ha prevalso sui pomodori all'inizio della stagione, ma in seguito è stato sostituito dalla gara T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). Dopo il 2000, il T1 sulle patate in molte popolazioni ha cominciato a manifestarsi proprio all'inizio dell'epifitosi. Negli Stati Uniti, i ceppi di patate erano non patogeni per il pomodoro, così come le razze T0, T1 e T2, mentre T1 e T2 predominavano sui pomodori (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Tipo di accoppiamento
Per condurre lo studio, sono necessari i ceppi (di riferimento) del tester con tipi di accoppiamento noti - A1 e A2. L'isolato di prova viene inoculato con essi a coppie in piastre Petri con terreno di agar d'avena. Dopo l'incubazione per 10 giorni, le piastre vengono esaminate per la presenza o l'assenza di oospore nel terreno nella zona di contatto dei ceppi. Ci sono 4 opzioni: il ceppo appartiene al tipo di accoppiamento A1, se forma oospore con il tester A2, ad A2, se forma oospore con il tester A1, ad A1A2, se forma oospore con entrambi i tester, o è sterile (00), se non forma oospore senza tester (gli ultimi due gruppi sono rari).
Per determinare più rapidamente i tipi di accoppiamento, si è cercato di identificare regioni del genoma associate al tipo di accoppiamento, con l'obiettivo di un loro ulteriore utilizzo per determinare il tipo di accoppiamento mediante PCR. Uno dei primi esperimenti riusciti per identificare un tale sito è stato condotto da ricercatori americani (Judelson et al., 1995). Utilizzando il metodo RAPD, sono stati in grado di identificare la regione W16 associata al tipo di accoppiamento nella prole dei due isolati incrociati e progettare una coppia di primer a 24 bp per la sua amplificazione (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') e W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Dopo restrizione del prodotto della PCR con l'enzima di restrizione HaeIII, è stato possibile separare gli isolati con accoppiamenti di tipo A1 e A2.
Un altro tentativo di ottenere marcatori PCR per determinare i tipi di accoppiamento è stato intrapreso da ricercatori coreani (Kim, Lee, 2002). Hanno identificato prodotti specifici utilizzando il metodo AFLP. Di conseguenza, sono state sviluppate una coppia di primer PHYB-1 (forward) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') e PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), consentendo l'amplificazione selettiva della regione del genoma associata al tipo di accoppiamento A2. Successivamente, hanno continuato questo lavoro e progettato i primer 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, forward) e 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), consentendo l'amplificazione selettiva della regione Mat-A1 caratteristica dei ceppi con il tipo di accoppiamento A1. L'uso della diagnostica PCR dei tipi di accoppiamento ha mostrato buoni risultati nello studio delle popolazioni di P. infestans nella Repubblica Ceca (Mazakova et al., 2006), in Tunisia (Jmour, Hamada, 2006) e in altre regioni. Nel nostro laboratorio (Mytsa, Elansky, non pubblicato), sono stati analizzati 34 ceppi di P. infestans isolati dagli organi colpiti di patate e pomodori in diverse regioni della Russia (regioni di Kostroma, Ryazan, Astrakhan e Mosca). I risultati dell'analisi PCR utilizzando primer specifici più del 90% sono coincisi con i risultati dell'analisi del tipo di accoppiamento con il metodo tradizionale su un mezzo nutritivo.
Tabella 1. Variabilità della resistenza all'interno del clone Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Luogo di raccolta del campione | Numero di isolati analizzati | Numero di ceppi sensibili (S), debolmente resistenti (SR) e resistenti (R), pz (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Città di Ekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Regione di Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Resistenza al metalaxile come marker di popolazione
All'inizio degli anni '1980, in varie regioni sono stati osservati potenti focolai di peronospora causati da ceppi di P. infestans metalaxil-resistenti. Gli allevamenti di patate in molti paesi hanno subito perdite significative (Dowley e O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Da allora, in molti paesi del mondo, è stato condotto un monitoraggio costante della presenza di ceppi resistenti alla fenilamide nelle popolazioni di P. infestans. Oltre a una valutazione pratica delle prospettive per l'uso di farmaci contenenti fenilamide, alla costruzione di un sistema di misure protettive e alla previsione delle epifitotie, la resistenza a questi farmaci è diventata una delle caratteristiche marker ampiamente utilizzate per l'analisi comparativa delle popolazioni di questo patogeno. Tuttavia, l'uso della resistenza al metalaxile in studi comparativi di popolazione dovrebbe essere effettuato tenendo conto del fatto che: 1 - la base genetica della resistenza non è stata ancora determinata con precisione, 2 - la resistenza al metalaxile è un tratto selettivamente dipendente che può variare a seconda dell'uso di fenilammidi, 3 - diverso il grado di sensibilità ai ceppi metalaxilici all'interno di una linea clonale (tabella 1).
Spettri di isoenzimi
I marcatori isozimici sono generalmente indipendenti dalle condizioni esterne, mostrano un'eredità mendeliana e sono codominanti, consentendo di distinguere tra omo ed eterozigoti. L'utilizzo di proteine come marcatori genici consente di identificare sia grandi riorganizzazioni del materiale genetico, comprese mutazioni cromosomiche e genomiche, sia sostituzioni di singoli aminoacidi.
Studi elettroforetici sulle proteine hanno dimostrato che la maggior parte degli enzimi esiste negli organismi sotto forma di diverse frazioni che differiscono nella mobilità elettroforetica. Queste frazioni sono il risultato della codifica di più forme di enzimi da loci diversi (isoenzimi o isoenzimi) o da diversi alleli dello stesso locus (allozimi o alloenzimi). Cioè, gli isoenzimi sono diverse forme di un enzima. Diverse forme hanno la stessa attività catalitica, ma differiscono leggermente nelle sostituzioni di singoli amminoacidi nel peptide e nella carica. Tali differenze vengono rivelate durante l'elettroforesi.
Nello studio dei ceppi di P. infestans vengono utilizzati gli spettri degli isoenzimi di due proteine, la peptidasi e l'isomerasi glucosio-6-fosfato (questo enzima è monomorfico nelle popolazioni russe, quindi i metodi del suo studio non sono presentati in questo lavoro). Per separarli in isoenzimi in un campo elettrico, i preparati proteici isolati dagli organismi studiati vengono applicati a una lastra di gel posta in un campo elettrico. La velocità di diffusione delle singole proteine nel gel dipende dalla carica e dal peso molecolare, quindi, in un campo elettrico, la miscela di proteine viene separata in frazioni separate, che possono essere visualizzate utilizzando coloranti speciali.
Lo studio degli isoenzimi peptidasi viene effettuato su gel di acetato di cellulosa, amido o poliacrilammide. Il più conveniente è il metodo basato sull'uso di gel di acetato di cellulosa prodotti da Helena Laboratories Inc. Non richiede grandi quantità di materiali di prova, consente di ottenere bande di contrasto sul gel dopo l'elettroforesi per entrambi i loci enzimatici, la sua implementazione non richiede tempi e costi di materiale elevati (Fig. 2).
Un piccolo pezzo di micelio viene trasferito in una microprovetta da 1,5 ml, vengono aggiunte 1-2 gocce di acqua distillata. Successivamente, il campione viene omogeneizzato (ad esempio con un trapano elettrico con attacco in plastica adatto a un microtubo) e fatto sedimentare per 25 secondi su una centrifuga a 13000 rpm. 8 ml da ogni microprovetta. il surnatante viene trasferito sulla piastra dell'applicatore.
Il gel di acetato di cellulosa viene rimosso dal contenitore del tampone, asciugato tra due fogli di carta da filtro e posizionato con lo strato di lavoro rivolto verso l'alto sulla base di plastica dell'applicatore. La soluzione dalla piastra viene trasferita dall'applicatore sul gel 2-4 volte. Il gel viene trasferito in una camera di elettroforesi,
Tabella 2. La composizione della soluzione utilizzata per la colorazione del gel di acetato di cellulosa nell'analisi degli isoenzimi peptidasi, una goccia di vernice (blu di bromofenolo) viene posta sul bordo del gel.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Perossidasi, 1000 U / ml 5 gocce
o-dianisidina, 4 mg / ml 8 gocce
MgCl2, 20 mg / ml 2 gocce
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 gocce
L-amminoacido ossidasi, 20 u / ml 2 gocce
L'elettroforesi viene eseguita per 20 minuti. a 200 V. Dopo l'elettroforesi, il gel viene trasferito su un tavolo di pittura e colorato con una soluzione di pittura speciale (Tabella 2). 10 ml di agar DIFCO all'1,6% vengono preliminarmente sciolti in un forno a microonde, raffreddati a 60 ° C, dopodiché 2 ml di agar vengono miscelati con una miscela di vernice e versati su un gel. Le strisce compaiono entro 15-20 minuti. Il reagente L-amminoacido ossidasi viene aggiunto immediatamente prima di miscelare la soluzione con agar fuso.
Nelle popolazioni russe, il locus Pep 1 è rappresentato dai genotipi 100/100 e 92/100. L'omozigote 92/92 è estremamente raro (circa lo 0,1%). Locus Rehr 2 è rappresentato da tre genotipi 100/100, 100/112 e 112/112 e tutte e 3 le varianti sono abbastanza comuni (Elanky e Smirnov, 2003, Fig.2).
Ricerca sul genoma
Polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con successiva ibridazione (RFLP-RG 57)
Il DNA totale viene trattato con l'enzima di restrizione Eco R1, i frammenti di DNA vengono separati mediante elettroforesi in gel di agarosio. Il DNA nucleare è molto grande e ha molte sequenze ripetitive, il che rende difficile analizzare direttamente i numerosi frammenti ottenuti dall'azione degli enzimi di restrizione. Pertanto, i frammenti di DNA separati nel gel vengono trasferiti su una speciale membrana e utilizzati per l'ibridazione con la sonda RG 57, che include nucleotidi etichettati con etichette radioattive o fluorescenti. Questa sonda si ibrida con sequenze genomiche ripetitive (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Dopo la visualizzazione dei risultati dell'ibridazione su un materiale leggero o radioattivo, si ottiene un profilo di ibridazione multi-locus (fingerprinting), rappresentato da 25-29 frammenti (Forbes et al., 1998). La prole asessuale (clonale) avrà gli stessi profili. Dalla disposizione delle bande sull'elettroforetogramma, vengono giudicate le somiglianze e le differenze degli organismi confrontati.
Aplotipi del DNA mitocondriale
Nella maggior parte delle cellule eucariotiche, il mtDNA si presenta sotto forma di una molecola di DNA circolare a doppio filamento che, a differenza dei cromosomi nucleari delle cellule eucariotiche, si replica in modo semi-conservativo e non è associata a molecole proteiche.
Il genoma mitocondriale di P. infestans è stato sequenziato e numerosi lavori sono stati dedicati all'analisi delle lunghezze dei frammenti di restrizione (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Dopo che Griffith e Shaw (1998) hanno sviluppato un metodo semplice e veloce per determinare gli aplotipi del mtDNA, questo marcatore è diventato uno dei più popolari negli studi di P. Infestans.L'essenza del metodo consiste nell'amplificazione sequenziale di due frammenti di DNA mitocondriale (dal genoma comune) con primer F2-R2 e F4-R4 (Tabella 3) e la loro successiva restrizione con enzimi di restrizione MspI (1 ° frammento) ed EcoR1 (2 ° frammento). Il metodo consente di identificare 4 aplotipi: Ia, IIa, Ib, IIb. Il tipo II differisce dal tipo I per la presenza di un inserto da 1881 bp e per una diversa posizione dei siti di restrizione nelle regioni P2 e P4 (Fig. 3).
Dal 1996, tra i ceppi raccolti sul territorio della Russia, sono stati rilevati solo gli aplotipi Ia e IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Possono essere identificati dopo la separazione dei prodotti di restrizione con primer F2-R2 in un campo elettrico (Fig. 4, 5). I tipi di mtDNA vengono utilizzati nell'analisi comparativa di ceppi e popolazioni. In un certo numero di lavori, sono stati utilizzati tipi di DNA mitocondriale per isolare le linee clonali e passportizzare isolati di P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Utilizzando il metodo PCR-RFLP, si è concluso che mtDNA è eterogeneo nello stesso ceppo di P. infestans (Elansky e Milyutina, 2007). Condizioni di amplificazione: 1x (500 sec.94 ° C), 40x (30 sec.90 ° C, 30 sec.52 ° C, 90 sec.72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Miscela di reazione: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polimerasi, 1x tampone MgCl2,5-Taq da 2 mM, 0,2 mM ogni dNTP, primer 30 pM e 5 ng del DNA analizzato, acqua deionizzata - fino a 20 μl.
La restrizione del prodotto della PCR viene effettuata per 4-6 ore ad una temperatura di 37 ° C. Miscela di restrizione (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x tampone di restrizione (2 μl), acqua deionizzata (6 μl), prodotto PCR (10 μl).
Tabella 3. Primer utilizzati per l'amplificazione delle regioni polimorfiche del mtDNA
Locus | Primer | Lunghezza e posizionamento del primer | Lunghezza del prodotto PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Random primer amplification (RAPD)
Quando si esegue RAPD, viene utilizzato un primer (a volte diversi primer contemporaneamente) con una sequenza nucleotidica arbitraria, di solito 10 nucleotidi di lunghezza, con un alto contenuto (dal 50%) di nucleotidi GC e una bassa temperatura di annealing (circa 35 ° C). Tali primer "atterrano" su numerosi siti complementari nel genoma. Dopo l'amplificazione, si ottiene un gran numero di ampliconi. Il loro numero dipende dal primer utilizzato e dalle condizioni di reazione (concentrazione di MgCl2 e temperatura di ricottura).
La visualizzazione degli ampliconi viene eseguita mediante distillazione in gel di poliacrilammide o agarosio. Quando si esegue l'analisi RAPD, è necessario monitorare attentamente la purezza del materiale analizzato, perché la contaminazione con altri oggetti viventi può causare un aumento significativo del numero di artefatti, che sono piuttosto numerosi nell'analisi del materiale puro (Perez et al, 1998). L'uso di questo metodo nello studio del genoma di P. infestans si riflette in molti lavori (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). La selezione delle condizioni di reazione e dei primer (sono stati studiati 51 primer a 10 nucleotidi) è fornita nell'articolo di Abu-El Samen et al., (2003).
Microsatellite Repeat Analysis (SSR)
Le ripetizioni dei microsatelliti (ripetizioni di sequenze semplici, SSR) sono brevi sequenze ripetute in tandem di 1-3 (a volte fino a 6) nucleotidi presenti nei genomi nucleari di tutti gli eucarioti. Il numero di ripetizioni successive può variare da 10 a 100. I loci microsatelliti si verificano con una frequenza abbastanza alta e sono distribuiti più o meno uniformemente in tutto il genoma (Lagercrantz et al., 1993). Il polimorfismo delle sequenze di microsatelliti è associato a differenze nel numero di ripetizioni del motivo di base. I marcatori dei microsatelliti sono codominanti, il che rende possibile utilizzarli per analizzare la struttura di una popolazione, determinare la parentela, i percorsi di migrazione dei genotipi, ecc. Tra gli altri vantaggi di questi marcatori, si dovrebbe notare il loro alto polimorfismo, buona riproducibilità, neutralità e la capacità di eseguire analisi e valutazioni automatiche.L'analisi del polimorfismo delle ripetizioni dei microsatelliti viene effettuata mediante amplificazione PCR utilizzando primer complementari a sequenze uniche che fiancheggiano i loci dei microsatelliti. Inizialmente l'analisi è stata condotta con la separazione dei prodotti di reazione su gel di poliacrilammide. Successivamente, i dipendenti della società Applied Biosystems hanno proposto di utilizzare primer marcati in modo fluorescente con il rilevamento di prodotti di reazione utilizzando un rilevatore laser automatico (Diehl et al., 1990), e quindi sequenziatori di DNA automatici standard (Ziegle et al., 1992). L'etichettatura di primer con vari coloranti fluorescenti consente di analizzare più marker contemporaneamente su una corsia e, di conseguenza, aumentare significativamente la produttività del metodo e aumentare l'accuratezza dell'analisi.
Le prime pubblicazioni dedicate all'uso dell'analisi SSR per lo studio di P. infestans sono apparse all'inizio degli anni 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Non tutti i marcatori proposti dagli autori hanno mostrato un grado sufficiente di polimorfismo, tuttavia, due di essi (4B e G11) sono stati inclusi nel set di 12 marcatori SSR proposti da Lees et al. (2006) e successivamente adottati dalla rete di ricerca Eucablight (www.eucablight .org) come standard per P. infestans. Alcuni anni dopo, è stato pubblicato uno studio sulla creazione di un sistema per l'analisi multiplex del DNA di P. infestans basato su otto marcatori SSR (Li et al., 2010). Infine, dopo aver valutato tutti i marcatori proposti in precedenza e selezionato il più informativo di essi, nonché ottimizzato i primer, le etichette fluorescenti e le condizioni di amplificazione, lo stesso team di autori ha presentato un sistema per l'analisi multiplex in una fase, inclusi 12 marcatori (Tabella 4; Li et al. , 2013a). I primer utilizzati in questo sistema sono stati selezionati ed etichettati con uno dei quattro marker fluorescenti (FAM, VIC, NED, PET) in modo che gli intervalli delle dimensioni degli alleli dei primer con le stesse etichette non si sovrappongano.
Gli autori hanno eseguito l'analisi su un amplificatore PTC200 (MJ Research, USA) utilizzando kit PCR multiplex QIAGEN o kit PCR QIAGEN Typeit Microsatellite. Il volume della miscela di reazione era 12.5 μl. Le condizioni di amplificazione erano le seguenti: per QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 sec), 58 ° C (90 sec), 72 ° C (60 sec), 72 ° C (20 min); per QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sec), 58 ° C (90 sec), 72 ° C (20 sec), 60 ° C (30 min).
La separazione e la visualizzazione dei prodotti della PCR sono state eseguite utilizzando un analizzatore automatico di DNA capillare ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabella 4. Caratteristiche dei 12 marcatori SSR standard utilizzati per la genotipizzazione di P. Infestans (Li et al., 2013a)
Nome | Numero di alleli | Gamma di dimensioni alleli (bp) | Primer |
Maiale11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATTCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Un esempio di visualizzazione dei risultati dell'analisi è mostrato in Fig. 6. I risultati sono stati analizzati utilizzando il software GeneMapper 3.7 confrontando i dati ottenuti con quelli di isolati noti. Per facilitare l'interpretazione dei risultati dell'analisi, è necessario includere 1-2 isolati di riferimento con un genotipo noto in ogni studio.
Il metodo di ricerca proposto è stato testato su un numero significativo di campioni sul campo, dopodiché gli autori hanno standardizzato i protocolli tra i laboratori di due organizzazioni, The James Hutton Institute (UK) e Wageningen University & Research (Paesi Bassi), che, insieme alla possibilità di utilizzare schede FTA standard per la raccolta e la spedizione di campioni di DNA di P. infestans, ha permesso di parlare della possibilità di utilizzo commerciale di questo sviluppo. Inoltre, un metodo rapido e accurato per la genotipizzazione degli isolati di P. infestans utilizzando l'analisi SSR multiplex ha reso possibile condurre studi standardizzati su popolazioni di questo patogeno su scala globale e la creazione di un database mondiale sulla peronospora nell'ambito del progetto Eucablight (www.eucablight.org), incluso , compresi i risultati dell'analisi dei microsatelliti, hanno permesso di monitorare l'emergenza e la diffusione di nuovi genotipi in tutto il mondo.
Polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione amplificato (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) è una tecnologia per la generazione di marcatori molecolari casuali utilizzando primer specifici. In AFLP, il DNA viene trattato con una combinazione di due enzimi di restrizione. Adattatori specifici sono legati alle estremità adesive dei frammenti di restrizione.
Questi frammenti vengono quindi amplificati utilizzando primer complementari alla sequenza dell'adattatore e al sito di restrizione e inoltre trasportano una o più basi casuali alle loro estremità 3 '. L'insieme dei frammenti ottenuti dipende dagli enzimi di restrizione e dai nucleotidi selezionati casualmente alle estremità 3 'dei primer (Vos et al., 1995). AFLP: la genotipizzazione viene utilizzata per studiare rapidamente la variazione genetica di vari organismi.
Una descrizione dettagliata del metodo è fornita nei lavori di Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Molto lavoro di confronto tra la risoluzione dei metodi AFLP e SSR è stato svolto da ricercatori cinesi. Sono state studiate le caratteristiche fenotipiche e genotipiche di 48 isolati di P. infestans raccolti da cinque regioni della Cina settentrionale. Gli spettri AFLP hanno rivelato otto diversi genotipi di DNA, in contrasto con i genotipi SSR, per i quali non è stata trovata alcuna diversità (Guo et al., 2008).
Amplificazione con primer omologhi alle sequenze di elementi mobili
I marcatori derivati da sequenze di retrotrasposoni sono molto convenienti per la mappatura genetica, lo studio della diversità genetica e dei processi evolutivi (Schulman, 2006). Se i primer sono realizzati per completare le sequenze stabili di alcuni elementi mobili, è possibile amplificare le regioni del genoma situate tra di loro. Negli studi sull'agente eziologico della peronospora, è stato applicato con successo il metodo di amplificazione di parti del genoma utilizzando un primer complementare alla sequenza centrale del retropazone SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) (Lavrova e Elansky, 2003). Utilizzando questo metodo, sono state rilevate differenze anche nella prole asessuata di un isolato. A questo proposito, si è concluso che il metodo inter-SINE-PCR è altamente specifico e la velocità di movimento degli elementi SINE nel genoma di Phytophthora è elevata.
Nel genoma di P. infestans sono state identificate 12 famiglie di retrotrasposoni brevi (SINE); è stata studiata la distribuzione delle specie dei retrotrasposoni brevi, sono stati identificati elementi (SINE) che si trovano nel genoma solo di P. infestans (Lavrova, 2004).
Caratteristiche dell'applicazione dei metodi di studio comparativo dei ceppi negli studi sulla popolazione
Quando si pianifica uno studio, è necessario comprendere chiaramente gli obiettivi che persegue e utilizzare i metodi appropriati. Pertanto, alcuni metodi consentono di generare un gran numero di caratteristiche di marker indipendenti, ma allo stesso tempo hanno una bassa riproducibilità e dipendono fortemente dai reagenti utilizzati, dalle condizioni di reazione e dalla contaminazione del materiale in esame. Pertanto, in ogni studio di un gruppo di ceppi, è necessario utilizzare diversi isolati standard (di riferimento), ma anche in questo caso i risultati di diversi esperimenti sono molto difficili da combinare.
Questo gruppo di metodi include RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Dopo l'amplificazione, si ottiene un gran numero di frammenti di DNA di diverse dimensioni. Si consiglia di utilizzare tali tecniche se è necessario stabilire differenze tra ceppi strettamente correlati (genitore-prole, mutanti di tipo selvatico, ecc.) O nei casi in cui è richiesta un'analisi dettagliata di un piccolo campione. Pertanto, il metodo AFLP è ampiamente utilizzato nella mappatura genetica di P. infestans (van der Lee et al., 1997) e negli studi sull'intrapopolazione (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Tali metodi non sono appropriati da utilizzare durante la creazione di database di ceppi, perché è praticamente impossibile unificare la contabilità dei risultati quando si conducono analisi in laboratori diversi.
Nonostante l'apparente semplicità e velocità di esecuzione (isolamento del DNA senza una buona purificazione, amplificazione, visualizzazione dei risultati), questo gruppo di metodi richiede l'uso di un metodo speciale per documentare i risultati: distillazione in gel di poliacrilammide con primer marcati (radioattivamente o luminescenti) e successiva esposizione a luce o materiale radioattivo. L'imaging convenzionale con gel di agarosio di bromuro di etidio non è generalmente adatto a questi metodi perché un gran numero di frammenti di DNA di diverse dimensioni può fondersi.
Altri metodi, al contrario, permettono di generare un piccolo numero di caratteristiche con la loro elevatissima riproducibilità. Questo gruppo comprende lo studio degli aplotipi del DNA mitocondriale (solo due aplotipi Ia e IIa sono notati in Russia), del tipo di accoppiamento (la maggior parte degli isolati è suddivisa in 2 tipi: A1 e A2, SF autofertile si trovano raramente) e spettri isoenzimatici della peptidasi (due loci Pep1 e Pep2 , composto da due isoenzimi ciascuno) e isomerasi glucosio-6-fosfato (in Russia non c'è variabilità in questo tratto, sebbene in altri paesi del mondo si noti un polimorfismo significativo). Si consiglia di utilizzare queste funzionalità durante l'analisi delle raccolte, la compilazione di database regionali e globali. Nel caso dell'analisi degli isoenzimi e degli aplotipi del DNA mitocondriale è possibile fare a meno dei ceppi standard, mentre nell'analisi dei tipi di accoppiamento sono richiesti due isolati di prova con tipi di accoppiamento noti.
Le condizioni di reazione e i reagenti possono influenzare solo il contrasto del prodotto sull'elettroforetogramma; la manifestazione di artefatti in questi tipi di studi è improbabile.
Attualmente, la maggior parte delle popolazioni nella parte europea della Russia sono rappresentate da ceppi di entrambi i tipi di accoppiamento (Tabella 6), tra questi ci sono isolati con i tipi Ia e IIa di DNA mitocondriale (altri tipi di mtDNA trovati nel mondo non sono stati trovati in Russia dopo il 1993). Gli spettri degli isoenzimi della peptidasi sono rappresentati da due genotipi al locus Pep1 (100/100, 92/92 ed eterozigote 92/100, e il genotipo 92/92 è estremamente raro (<0,3%)) e da due genotipi al locus Pep 2 (100/100 , 112/112 ed eterozigote 100/112, con il genotipo 112/112 che si verifica meno frequentemente di 100/100, ma anche abbastanza spesso).
Non c'era variabilità nello spettro degli isoenzimi dell'isomerasi glucosio-6-fosfato dopo il 1993 (scomparsa della linea clonale US-1); tutti gli isolati studiati avevano il genotipo 100/100 (Elansky e Smirnov, 2002).
Il terzo gruppo di metodi consente di ottenere un gruppo sufficiente di caratteristiche di marker indipendenti con elevata riproducibilità. Oggi, questo gruppo include la sonda RFLP-RG57, che produce 25-29 frammenti di DNA di diverse dimensioni. RFLP-RG57 può essere utilizzato sia durante l'analisi di campioni che durante la compilazione di database. Tuttavia, questo metodo è molto più costoso dei precedenti, richiede tempo e una quantità sufficientemente grande di DNA altamente purificato. Pertanto, il ricercatore è costretto a limitare il volume del materiale testato.
Lo sviluppo di RFLP-RG57 all'inizio degli anni '90 del secolo scorso ha intensificato in modo significativo gli studi sulla popolazione dell'agente eziologico della peronospora. È diventata la base del metodo basato sulla selezione e analisi delle "linee clonali" (vedi sotto). Insieme a RFLP-RG57, il tipo di accoppiamento, il fingerprinting del DNA (metodo RFLP-RG57), gli spettri degli isoenzimi della peptidasi e della glucosio-6-fosfato isomerasi e il tipo di DNA mitocondriale vengono utilizzati per identificare le linee clonali. Grazie a lui, è stato mostrato al., 1994), sono state identificate la sostituzione di vecchie popolazioni con nuove (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a) e le linee clonali prevalenti in molti paesi del mondo. Gli studi sui ceppi russi utilizzando questo metodo hanno mostrato un elevato polimorfismo genotipico dei ceppi della parte europea e monomorfismo delle popolazioni delle parti asiatiche e dell'Estremo Oriente della Russia (Elansky et al, 2001). E ora questo metodo rimane il principale negli studi sulla popolazione di P. infestans. Tuttavia, la sua ampia distribuzione è ostacolata dal costo piuttosto elevato e dall'intensità di lavoro in esecuzione.
Un'altra tecnica promettente che viene utilizzata raramente negli studi su P. infestans è l'analisi della ripetizione dei microsatelliti (SSR). Attualmente, questo metodo è ampiamente utilizzato per isolare le linee clonali. Per l'analisi dei ceppi, sono stati ampiamente utilizzati (e continuano ad essere utilizzati) i tratti marcatori fenotipici come la presenza di geni di virulenza nelle varietà di patate (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) e il pomodoro. Ormai, i geni per la virulenza delle varietà di patate hanno perso il loro valore come tratti marcatori per gli studi sulla popolazione a causa della comparsa del numero massimo (o vicino ad esso) di geni di virulenza nella stragrande maggioranza degli isolati. Allo stesso tempo, il gene di virulenza T1 per cultivar di pomodoro portanti il corrispondente gene Ph1 è ancora utilizzato con successo come tratto marcatore (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
In molti lavori, la resistenza ai fungicidi è utilizzata come tratto distintivo. Questo tratto non è desiderabile da utilizzare negli studi di popolazione a causa della comparsa piuttosto facile di mutazioni di resistenza nelle linee clonali dopo l'applicazione di fungicidi contenenti metalaxil- (o mefenoxam-) nel campo. Ad esempio, differenze significative nel livello di resistenza sono state mostrate all'interno della linea clonale Sib1 (Elansky et al., 2001).
Pertanto, il tipo di accoppiamento, lo spettro dell'isoenzima della peptidasi, il tipo di DNA mitocondriale, RFLP-RG57, SSR sono le caratteristiche dei marcatori preferiti per la creazione di banche dati ed etichettatura dei ceppi nelle raccolte. Per confrontare campioni limitati, se è necessario applicare il numero massimo di caratteristiche del marker, è possibile utilizzare AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabella 5). Tuttavia, va ricordato che questi metodi sono scarsamente riproducibili e in ogni singolo esperimento (ciclo di elettroforesi di amplificazione) è necessario utilizzare diversi isolati di riferimento.
Tabella 5. Confronto di metodi diversi di ricerca di tensioni P. infestans
criterio | TC | Poliziotti Isofer | DNA mitocondriale | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Quantità di informazioni | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Riproducibilità | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Possibilità di manufatti | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
costo | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensità lavorativa | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Velocità di analisi ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Nota: H - basso, C - medio, B - alto; НС * - l'intensità del lavoro è bassa quando si utilizza il gel di agarosio o automatico
genotipro, mezzo - per distillazione in gel di poliacrilammide con primer etichettati,
** - senza contare il tempo dedicato alla crescita del micelio per l'isolamento del DNA.
Struttura della popolazione
Linee clonali
In assenza di ricombinazione o di un suo contributo insignificante alla struttura della popolazione, la popolazione è costituita da un certo numero di cloni, i cui scambi genetici sono estremamente rari.
In tali popolazioni, è più informativo studiare non le frequenze dei singoli geni, ma le frequenze dei genotipi che hanno un'origine comune (linee clonali o lignaggi clonali) e differiscono solo per le mutazioni puntiformi. Gli studi sulla popolazione del patogeno della peronospora e l'analisi delle linee clonali hanno subito un'accelerazione significativa dall'avvento del metodo RFLP-RG57 all'inizio degli anni '90 del secolo scorso. Insieme a RFLP-RG57, il tipo di accoppiamento, gli spettri degli isoenzimi della peptidasi e della glucosio-6-fosfato isomerasi e il tipo di DNA mitocondriale vengono utilizzati per identificare le linee clonali. Le caratteristiche delle linee clonali più comuni sono riportate nella Tabella 6.
Il clone US-1 ha dominato le popolazioni ovunque fino alla fine degli anni '80, dopodiché iniziò a essere sostituito da altri cloni e scomparve dall'Europa e dal Nord America. Si trova ora in Estremo Oriente (Filippine, Taiwan, Cina, Giappone, Corea, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), in Africa (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al. al., 2000; Ochwo et al., 2002) e in Sud America (Ecuador, Brasile, Perù, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Nessun ceppo appartenente alla linea US-1 è stato identificato nella sola Australia. Apparentemente, gli isolati di P. infestans sono arrivati in Australia con un'altra ondata di migrazione (Goodwin, 1997).
Il clone US-6 migrò dal Messico settentrionale alla California alla fine degli anni '70 e lì causò un'epidemia di patate e pomodori dopo 32 anni senza malattie. A causa della sua elevata aggressività, rimpiazzò il clone US-1 e iniziò a dominare sulla costa occidentale degli Stati Uniti (Goodwin et al., 1995a).
I genotipi US-7 e US-8 furono scoperti negli Stati Uniti nel 1992 e già nel 1994 erano ampiamente distribuiti negli Stati Uniti e in Canada. Durante una stagione sul campo, il clone US-8 è in grado di spostare quasi completamente il clone US-1 in appezzamenti di patate inizialmente infettati con entrambi i cloni a una concentrazione uguale (Miller e Johnson, 2000).
I cloni da BC-1 a BC-4 sono stati identificati nella Columbia Britannica in un piccolo numero di isolati da Goodwin et al., 1995b). Il clone US-11 si diffuse ampiamente negli Stati Uniti e soppiantò US-1 a Taiwan. I cloni JP-1 e EC-1, insieme al clone US-1, sono comuni rispettivamente in Giappone ed Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 è un clone che ha prevalso in Russia su un vasto territorio dalla regione di Mosca a Sakhalin. Nella regione di Mosca, è stato scoperto nel 1993 e alcune popolazioni di campo erano costituite principalmente da ceppi di questa linea clonale, altamente resistenti al metalaxil. Dopo il 1993, la prevalenza di questo clone è diminuita in modo significativo. Fuori dagli Urali, nel 1997-1998, SIB-1 è stato trovato ovunque tranne che nel territorio di Khabarovsk (il clone SIB-2 è molto diffuso lì). La separazione spaziale dei cloni con diversi tipi di accoppiamento esclude il processo sessuale in Siberia e in Estremo Oriente. Nella regione di Mosca, a differenza della Siberia, la popolazione è rappresentata da molti cloni; quasi tutti gli isolati hanno un genotipo multilocus unico (Elansky et al., 2001, 2015). Questa diversità non può essere spiegata unicamente dall'importazione di ceppi del fungo da diverse parti del mondo con materiale di semi importato. Poiché entrambi i tipi di accoppiamento si verificano nella popolazione, è possibile che la sua diversità sia dovuta anche alla ricombinazione. Pertanto, nella Columbia Britannica, si presume l'emergere dei genotipi BC-2, BC-3 e BC-4 a causa dell'ibridazione dei cloni BC-1 e US-6 (Goodwin et al., 1995b). È possibile che ceppi ibridi si trovino nelle popolazioni di Mosca. Ad esempio, i ceppi MO-4, MO-8 e MO-11 eterozigoti per il locus PEP possono essere ibridi tra i ceppi MO-12, MO-21, MO-22, aventi il tipo di accoppiamento A2 e omozigoti per un allele del locus PEP e il ceppo MO-8, avente il tipo di accoppiamento A1 e omozigote per l'altro allele del locus. E se è così, e nelle popolazioni moderne di P. infestans c'è una tendenza ad un aumento del ruolo del processo sessuale, allora il valore informativo dell'analisi dei cloni multilocus diminuirà (Elansky et al., 2001, 2015).
Variazione nelle linee clonali
Fino agli anni '90 del XX secolo, la linea clonale US-20 era diffusa nel mondo. La maggior parte delle popolazioni di campo e regionali era costituita esclusivamente da ceppi con genotipo US-1. Tuttavia, sono state osservate anche differenze tra gli isolati, molto probabilmente causate da un processo mutazionale. Mutazioni si sono verificate sia nel DNA nucleare che mitocondriale e hanno influenzato, tra le altre cose, il livello di resistenza ai farmaci fenilamide e il numero di geni di virulenza. Le linee che differiscono dai genotipi originali per mutazioni sono indicate da numeri aggiuntivi dopo il punto che segue il nome del genotipo originale (ad esempio, la linea mutante US-1 della linea clonale US-1.1). Le linee di DNA per il fingerprinting US-1 e US-1.5 contengono linee accessorie di diverse dimensioni (Goodwin et al., 1.6a, 1995b); anche la linea clonale US-1995 differisce da US-6.3 per una linea di accessori (Goodwin, 6, Tabella 1997).
Nello studio del DNA mitocondriale, è stato scoperto che solo il DNA mitocondriale di tipo 1b si trova nella linea clonale US-1 (Carter et al., 1990). Tuttavia, nello studio di ceppi di questa stirpe clonale dal Perù e dalle Filippine, sono stati trovati isolati il cui tipo di DNA mitocondriale differiva da 1b in presenza di inserzioni e delezioni (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabella 6. Genotipi multilocus di alcune linee clonali di P. infestans
Nome | Tipo di accoppiamento | Isozymes | Impronte digitali del DNA | Tipo di MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 24 + | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 24 + | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 24 + | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 24 + | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 24 + | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 24 + | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 24 + | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 24 + | II bis |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | II bis |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | II bis |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 24 + | II bis |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | II bis |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 24 + | II bis |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 24 + | II bis |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 24 + | II bis |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 24 + | II bis |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 24 + | II bis |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | II bis |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 24 + | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 22 + | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 23 + | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 24 + | II bis |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 24 + | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 24 + | II bis |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | II bis |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | II bis |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | II bis |
Nota: * - nessun dato.
Tabella 7. Genotipi Multilocus e loro linee mutanti
Nome | Tipo di accoppiamento | | Impronte digitali del DNA (RG57) | Note | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Genotipo originale 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutazione in PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutazione in RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutazione in RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutazione in RG57 e PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutazione in RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Genotipo originale 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutazione in PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutazione in RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutazione in RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutazione in RG57 e PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutazione in RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Genotipo originale 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutazione in RG57 |
Ci sono anche cambiamenti negli spettri degli isoenzimi. Di regola, sono causati dalla scomposizione di un organismo inizialmente eterozigote per questo enzima in omozigoti. Nel 1993, sui frutti di pomodoro, abbiamo identificato un ceppo con caratteristiche caratteristiche di US-1: impronta digitale RG57, tipo di DNA mitocondriale e genotipo 86/100 per glucosio-6-fosfati-isomerasi, ma era omozigote (100/100) per il primo locus peptidasi invece di un eterozigote 92/100 tipico di questa linea clonale. Abbiamo chiamato il genotipo di questo ceppo MO-17 (Tabella 6). Le linee mutanti US-1.1 e US-1.4 differiscono anche da US-1 per le mutazioni nel primo locus della peptidasi (Tabella 7).
Le mutazioni che portano a cambiamenti nel numero di geni di virulenza per le varietà di patate e pomodori sono abbastanza comuni. Sono stati rilevati tra gli isolati della linea clonale US-1 nelle popolazioni dei Paesi Bassi (Drenth et al., 1994), Perù (Goodwin et al., 1995a), Polonia (Sujkowski et al., 1991), Nord America settentrionale (Goodwin et al., ., 1995b). Sono state notate differenze nel numero di geni di virulenza della patata anche tra gli isolati delle linee clonali US-7 e US-8 in Canada e negli Stati Uniti (Goodwin et al., 1995a), tra gli isolati della linea SIB-1 nella parte asiatica della Russia (Elansky et al, 2001 ).
Sono stati identificati isolati con forti differenze nei livelli di resistenza ai farmaci fenilammide in popolazioni di campi monoclonali, che appartenevano tutti alla linea clonale Sib-1 (Elansky et al, 2001, Tabella 1). Quasi tutti i ceppi della linea clonale US-1 sono altamente sensibili al metalaxile; tuttavia, isolati altamente resistenti di questa linea sono stati isolati nelle Filippine (Koh et al., 1994) e in Irlanda (Goodwin et al., 1996).
Popolazioni moderne di P. infestans
America Centrale (Messico)
La popolazione di P. infestans in Messico differisce notevolmente dalle altre popolazioni mondiali, principalmente a causa della sua posizione storica. Numerosi studi su questa popolazione e sulle specie correlate di P. infestans del clade Phytophthora, nonché sulle specie locali del genere Solanum, hanno portato alla conclusione che l'evoluzione del patogeno nella parte centrale del Messico è avvenuta insieme all'evoluzione delle piante ospiti ed è stata associata alla ricombinazione sessuale (Grünwald, Flier , 2005). Entrambi i tipi di accoppiamento sono rappresentati nella popolazione, e in proporzioni uguali, e la presenza di oospore nel suolo, su piante e tuberi di patate e specie selvatiche affini Solanum conferma la presenza di un processo sessuale nella popolazione (Fernández-Pavía et al., 2002). Recenti studi sulla Valle di Toluca e sui suoi dintorni (presunto centro di origine del patogeno) hanno confermato l'elevata diversità genetica della popolazione locale di P. infestans (134 genotipi multilocus in un campione di 176 campioni) e la presenza di numerose sottopopolazioni differenziate nella regione (Wang et al., 2017). I fattori che contribuiscono a questa differenziazione sono la divisione spaziale delle sottopopolazioni caratteristiche degli altipiani del Messico centrale, le differenze nelle condizioni di coltivazione e le varietà di patate utilizzate nelle valli e nelle montagne e la presenza di specie tuberose selvatiche di Solanum che possono agire come ospiti alternativi (Fry et al ., 2009).
Tuttavia, va notato che le popolazioni di P. infestans nel Messico settentrionale sono di natura più clonale e sono più simili alle popolazioni nordamericane, il che può indicare che questi sono i nuovi genotipi (Fry et al., 2009).
America del Nord
Le popolazioni nordamericane di P. infestans hanno sempre avuto una struttura molto semplice e il loro carattere clonale è stato stabilito molto prima dell'uso dell'analisi dei microsatelliti. Fino al 1987, la linea clonale US-1 ha dominato negli Stati Uniti e in Canada (Goodwin et al., 1995). A metà degli anni '70, quando apparvero i fungicidi a base di metalaxil, questo clone iniziò a essere sostituito da altri genotipi più resistenti che migrarono dal Messico (Goodwin et al., 1998). Entro la fine degli anni '90. il genotipo US-8 ha completamente sostituito il genotipo US-1 negli Stati Uniti ed è diventato la linea clonale dominante sulle patate (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). La situazione era diversa con i pomodori, che contenevano costantemente diverse linee clonali, e la loro composizione cambiava di anno in anno (Fry et al., 2009).
Nel 2009, negli Stati Uniti è scoppiata un'epidemia su larga scala di peronospora sui pomodori. Una caratteristica di questa pandemia è stata la sua insorgenza quasi simultanea in molti luoghi degli Stati Uniti nordorientali e si è rivelata essere associata a massicce vendite di piantine di pomodoro infette in grandi garden center (Fry et al., 2013). Le perdite di raccolto furono enormi. L'analisi dei microsatelliti dei campioni interessati ha rivelato che il ceppo pandemico apparteneva all'accoppiamento di tipo A22 della linea clonale US-2. Nel 2009, la quota di questo genotipo nella popolazione americana di P. infestans ha raggiunto l'80% (Fry et al., 2013). Negli anni successivi, la percentuale di genotipi aggressivi US-23 (principalmente su pomodori) e US-24 (su patate) è aumentata costantemente nella popolazione, tuttavia, dopo il 2011, il tasso di rilevamento di US-24 è diminuito in modo significativo e, ad oggi, circa il 90% della popolazione patogena in Gli Stati Uniti sono rappresentati dal genotipo US-23 (Fry et al., 2015).
In Canada, come negli Stati Uniti, alla fine degli anni '90. il genotipo dominante US-1 è stato soppiantato da US-8, le cui posizioni dominanti sono rimaste invariate fino al 2008. In Canada, si sono verificate gravi epidemie di peronospora associate alla vendita di piantine di pomodoro infette, ma sono state causate dai genotipi US-2009 e US-2010 (Kalischuk et al., 23). La chiara differenziazione geografica di questi genotipi era notevole: gli Stati Uniti-8 dominavano le province occidentali del Canada (2012%), mentre gli Stati Uniti-23 dominavano le province orientali (68%). Negli anni successivi, l'US-8 si è diffuso nelle regioni orientali; tuttavia, in generale, la sua quota nella popolazione è leggermente diminuita sullo sfondo della comparsa dei genotipi US-83 e US-23 nel paese (Peters et al., 22). Ad oggi, US-24 mantiene una posizione dominante in tutto il Canada; US-2014 è presente nella British Columbia, mentre US-23 e US-8 sono presenti in Ontario (Peters, 23).
Pertanto, le popolazioni nordamericane di P. infestans sono principalmente linee clonali. Negli ultimi 40 anni, il numero di genotipi clonali rilevati ha raggiunto 24. Nonostante il fatto che nella popolazione siano presenti ceppi di entrambi i tipi di accoppiamento, la probabilità della comparsa di nuovi genotipi come risultato della ricombinazione sessuale rimane piuttosto bassa. Tuttavia, negli ultimi 20 anni, sono stati registrati diversi casi di comparsa di popolazioni ricombinanti effimere (Gavino et al., 2000; DANIA et al., 2014; Peters et al., 2014) e in un caso il risultato dell'incrocio è stato il genotipo US-11 , che è stato trincerato in Nord America per molti anni (Gavino et al., 2000). Fino al 2009, i cambiamenti nella struttura delle popolazioni erano associati all'emergere di nuovi genotipi più aggressivi con la loro successiva migrazione e spostamento dei predecessori precedentemente dominanti. Cosa è successo nel 2009-2010 negli Stati Uniti e in Canada, gli epifitotici hanno dimostrato per la prima volta che nell'era della globalizzazione, i focolai della malattia possono essere associati alla diffusione attiva di nuovi genotipi quando si vende materiale vegetale infetto.
Sudamerica
Fino a tempi recenti, gli studi sulle popolazioni sudamericane di P. infestans non erano né regolari né su larga scala. È noto che la struttura di queste popolazioni è abbastanza semplice e include 1-5 lignaggi clonali per paese (Forbes et al., 1998). Quindi, nel 1998, i genotipi US-1 (Brasile, Cile) BR-1 (Brasile, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Perù e Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 e AR-5 (Argentina), PE-3 e PE-7 (Perù meridionale). Il tipo di accoppiamento A2 era presente in Brasile, Bolivia e Argentina e non è stato trovato oltre il confine boliviano-peruviano nell'area del lago Titicaca, dietro il quale dominava il genotipo EC-1 A1 nelle Ande. Sui pomodori, l'US-1 è rimasto il genotipo dominante in tutto il Sud America.
La situazione è più o meno perdurata negli anni 2000. Un punto importante è stata la scoperta di una nuova linea clonale EC-2 di tipo A2 su parenti selvatici di patate (S. brevifolium e S. tetrapetalum) nelle Ande settentrionali (Oliva et al., 2010). Studi filogenetici hanno dimostrato che questa linea non è del tutto identica a P. infestans, sebbene sia strettamente correlata ad essa, a questo proposito si è proposto di considerarla, così come un'altra linea, EC-3, isolata dall'albero di pomodoro S. betaceum che cresce nelle Ande, una nuova specie chiamata P. andina; tuttavia, lo stato di questa specie (una specie indipendente o un ibrido di P. infestans con qualche linea ancora sconosciuta) è ancora poco chiaro (Delgado et al., 2013).
Attualmente, tutte le popolazioni sudamericane di P. infestans sono clonali. Nonostante la presenza di entrambi i tipi di accoppiamento, non sono state identificate popolazioni ricombinanti. Sui pomodori, il genotipo US-1 è onnipresente, apparentemente sostituito dalle patate da ceppi locali, la cui origine esatta è ancora sconosciuta. In Brasile, Bolivia e Uruguay è presente il genotipo BR-1; in Perù, insieme a US-1 ed EC-1, ci sono molti altri genotipi locali. Sulle Ande, la posizione dominante è mantenuta dalla linea clonale EC-1, la cui relazione con la P. andina recentemente scoperta rimane sconosciuta. L'unico posto "instabile" dove per il periodo 2003-2013. ci sono stati cambiamenti significativi nella popolazione, è diventato il Cile (Acuña et al., 2012), dove nel 2004-2005. la popolazione patogena è stata caratterizzata dalla resistenza al metalaxil e un nuovo aplotipo di DNA mitocondriale (Ia invece del precedente Ib). 2006-2011 nella popolazione dominava il genotipo 21 (secondo SSR), la cui quota raggiungeva il 90%, dopodiché la palma è passata al genotipo 20, la cui frequenza di occorrenza nei due anni successivi si è mantenuta intorno al 67% (Acuña, 2015).
Europa
Nella storia dell'Europa ci sono state almeno due ondate migratorie di P. infestans dal Nord America: nel XIX secolo. (HERB-1) e all'inizio del XX secolo (US-1). La distribuzione onnipresente di fungicidi contenenti metalaxil negli anni '70. ha portato allo spostamento del genotipo dominante US-1 e alla sua sostituzione con nuovi genotipi. Di conseguenza, nella maggior parte dei paesi dell'Europa occidentale, le popolazioni dell'agente patogeno erano rappresentate principalmente da diverse linee clonali.
L'utilizzo dell'analisi dei microsatelliti per l'analisi delle popolazioni di patogeni ha permesso di rivelare gravi cambiamenti avvenuti in Europa occidentale nel 2005-2008. Nel 2005 è stata scoperta una nuova linea clonale nel Regno Unito, denominata 13_A2 (o “Blue 13”) e caratterizzata dal tipo di accoppiamento A2 , elevata aggressività e resistenza alle fenilammidi (Shaw et al., 2007). Lo stesso genotipo è stato trovato in campioni raccolti nel 2004 nei Paesi Bassi e nel nord della Francia, il che suggerisce che sia migrato nel Regno Unito dall'Europa continentale, possibilmente con patate da semina (Cooke et al., 2007). Lo studio del genoma dei rappresentanti di questa linea clonale ha mostrato un alto grado di polimorfismo della sua sequenza (entro il 2016, il numero delle sue variazioni subclonali ha raggiunto 340) e un grado significativo di variazione nel livello di espressione genica, incl. geni effettori durante l'infezione delle piante (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Queste caratteristiche, insieme alla maggiore durata della fase biotrofica, potrebbero causare una maggiore aggressività di 13_A2 e la sua capacità di infettare anche varietà di patate resistenti alla peronospora.
Negli anni successivi, il genotipo si diffuse rapidamente nei paesi dell'Europa nordoccidentale (Gran Bretagna, Irlanda, Francia, Belgio, Paesi Bassi, Germania) con lo spostamento simultaneo dei genotipi precedentemente dominanti 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Secondo il sito www.euroblight.net, la quota di 13_A2 nella popolazione di questi paesi ha raggiunto il 60-80% e oltre; la presenza di questo genotipo è stata registrata anche in alcuni paesi dell'Europa orientale e meridionale. Tuttavia, nel 2009-2012. 13_A2 ha perso le sue posizioni dominanti in Gran Bretagna e Francia, cedendo alla linea 6_A1 (8_A1 in Irlanda), e nei Paesi Bassi e in Belgio è stata parzialmente sostituita dai genotipi 1_A1, 6_A1 e 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Ad oggi, circa il 70% della popolazione dell'Europa occidentale di P. infestans è monoclonale. Secondo il sito web www.euroblight.net, i genotipi dominanti nei paesi dell'Europa nord-occidentale (Regno Unito, Francia,
Paesi Bassi, Belgio) rimangono, approssimativamente in proporzioni uguali, 13_A2 e 6_A1, e quest'ultimo praticamente non si trova al di fuori della regione specificata (ad eccezione dell'Irlanda), ma ha già almeno 58 subcloni (Cooke, 2017). Le variazioni 13_A2 sono presenti in numero notevole in Germania e si osservano anche sporadicamente nei paesi dell'Europa centrale e meridionale. Il genotipo 1_A1 costituisce una parte significativa delle popolazioni del Belgio e in parte dei Paesi Bassi e della Francia. Il genotipo 8_A1 si è stabilizzato nella popolazione europea al livello del 3-6%, ad eccezione dell'Irlanda, dove mantiene la sua posizione di leadership ed è diviso in due sottocloni (Stellingwerf, 2017). Infine, nel 2016, è stato rilevato un aumento della frequenza di occorrenza di nuovi genotipi 36_A2 e 37_A2, registrato per la prima volta nel 2013-2014; ad oggi, questi genotipi si trovano nei Paesi Bassi e in Belgio e in parte in Francia e Germania, oltre che nella parte meridionale della Gran Bretagna (Cooke, 2017). Ogni anno circa il 20-30% della popolazione dell'Europa occidentale è rappresentata da genotipi unici.
A differenza dell'Europa occidentale, quando apparve il genotipo 13_A2, le popolazioni del Nord Europa (Svezia, Norvegia, Danimarca, Finlandia) erano rappresentate non da linee clonali, ma da un gran numero di genotipi unici (Brurberg et al.,
2011). Durante il periodo di diffusione attiva di 13_A2 nell'Europa occidentale, la presenza di questo genotipo in Scandinavia non è stata notata fino al 2011, quando è stato scoperto per la prima volta nello Jutland settentrionale (Danimarca), dove vengono coltivate principalmente varietà di patate industriali con l'uso attivo di metalaxil-contenenti fungicidi (Nielsen et al., 2014). Secondo www.euroblight.net, il genotipo 13_A2 è stato rilevato anche in diversi campioni dalla Norvegia e dalla Danimarca nel 2014 e in diversi campioni norvegesi nel 2016; inoltre, nel 2013 in Finlandia la presenza del genotipo 6_A1 è stata rilevata in piccola quantità. La ragione principale del fallimento di 13_A2 e di altre linee clonali nella conquista della Scandinavia è considerata la differenza climatica di questa regione rispetto ai paesi dell'Europa occidentale.
Oltre al fatto che le estati fresche e gli inverni freddi contribuiscono alla sopravvivenza non tanto del micelio vegetativo quanto delle oospore (Sjöholm et al., 2013), il congelamento del suolo in inverno (che di solito non si verifica nei paesi più caldi dell'Europa occidentale) contribuisce alla sincronizzazione della germinazione e della semina delle oospore. patata, che rafforza il loro ruolo come fonte di infezione primaria (Brurberg et al., 2011). Va anche notato che, nel nord, lo sviluppo dell'infezione da oospore supera lo sviluppo dell'infezione tuberosa, che alla fine impedisce il predominio di linee clonali ancora più aggressive, ma successivamente sviluppate (Yuen, 2012). La struttura delle popolazioni di P. infestans più studiate nei paesi dell'Europa orientale (Polonia, Stati baltici) è molto simile a quella scandinava.
Entrambi i tipi di accoppiamento sono presenti anche qui e la stragrande maggioranza dei genotipi determinati dall'analisi SSR sono unici (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Come nel Nord Europa, la distribuzione delle linee clonali (principalmente del genotipo 13_A2) praticamente non ha interessato le popolazioni locali del patogeno, che mantengono un alto livello di diversità con l'assenza di linee dominanti pronunciate.
La presenza di 13_A2 è occasionalmente osservata in campi con varietà di patate commerciali. In Russia, la situazione si sta sviluppando in modo simile. Analisi microsatellite di isolati di P. infestans raccolti nel 2008-2011 in 10 diverse regioni della parte europea della Russia, ha mostrato un alto grado di diversità genotipica e una completa mancanza di coincidenze con le linee clonali europee (Statsyuk et al., 2014). Diversi anni dopo, uno studio su campioni di P. infestans raccolti nella regione di Leningrado nel 2013-2014 ha mostrato differenze significative tra loro ei genotipi di questa regione identificati nello studio precedente. In entrambi gli studi non sono stati trovati genotipi dell'Europa occidentale (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
L'elevata diversità genetica delle popolazioni dell'Europa orientale di P. infestans e l'assenza di linee clonali dominanti in esse può essere correlata a diversi motivi. In primo luogo, come nel Nord Europa, le condizioni climatiche dei paesi considerati contribuiscono alla formazione di oospore come fonte primaria di infezione (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). In secondo luogo, una percentuale significativa di patate prodotte in questi paesi viene coltivata in piccole aziende agricole private, spesso circondate da foreste o altri ostacoli alla libera circolazione di materiale infettivo (Chmielarz et al., 2014). Di norma, le patate coltivate in tali condizioni non vengono praticamente trattate con sostanze chimiche e la scelta delle varietà si basa sulla loro resistenza alla peronospora, ad es. non vi è alcuna pressione selettiva per l'aggressività e la resistenza al metalaxil, che priva i genotipi resistenti, come 13_A2, di vantaggi rispetto ad altri genotipi (Chmielarz et al., 2014). Infine, a causa delle piccole dimensioni dei terreni, i loro proprietari di solito non praticano la rotazione delle colture, coltivando patate per anni nello stesso luogo, il che contribuisce all'accumulo di inoculi geneticamente diversi (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asia
Fino a poco tempo, la struttura delle popolazioni di P. infestans in Asia è rimasta relativamente poco conosciuta. Si sapeva che è rappresentato principalmente da linee clonali e l'effetto della ricombinazione sessuale sull'emergere di nuovi genotipi è molto piccolo. Quindi, ad esempio, nel 1997-1998. Nella parte asiatica della Russia (Siberia ed Estremo Oriente), la popolazione patogena era rappresentata da soli tre genotipi con predominanza del genotipo SIB-1 (Elansky et al., 2001). La presenza di linee patogene clonali è stata dimostrata in paesi come Cina, Giappone, Corea, Filippine e Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). La linea clonale US-1 ha dominato su un vasto territorio dell'Asia tra la fine degli anni '90 e l'inizio degli anni 2000. quasi ovunque iniziarono a essere sostituiti da altri genotipi, che, a loro volta, cedettero il posto a nuovi. Nella maggior parte dei casi, i cambiamenti nella struttura e nella composizione delle popolazioni nei paesi asiatici sono stati associati alla migrazione di nuovi genotipi dall'esterno. Quindi, in Giappone, ad eccezione del genotipo JP-3, tutti gli altri genotipi giapponesi che sono comparsi dopo US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) hanno un'origine esterna più o meno provata (Akino et al., 2011) ... Ci sono attualmente tre principali popolazioni di patogeni in Cina, che hanno una chiara divisione geografica; Non c'è o è molto debole un flusso genico tra queste popolazioni (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Il genotipo 13_A2 è apparso sul territorio della Cina nelle sue province meridionali (Yunnan e Sichuan) nel 2005-2007 e nel 2012-1014. è stato visto anche nel nord-est del paese (Li et al., 2013b). In India, 13_A2 è apparso presumibilmente nello stesso periodo della Cina, molto probabilmente con patate da semina infette (Chowdappa et al., 2015) e nel 2009-2010. ha causato una grave epifitosi di peronospora sul pomodoro nel sud del paese, dopodiché si è diffusa alle patate e nel 2014 ha causato un'epidemia di peronospora nel Bengala occidentale, che ha portato alla rovina e al suicidio di molti agricoltori locali (Fry, 2016).
Africa
Fino al 2008-2010 non sono stati effettuati studi sistematici di P. infestans nei paesi africani. Attualmente le popolazioni africane di P. infestans possono essere suddivise in due gruppi, e questa divisione è chiaramente associata al fatto che i tuberi-seme vengono importati dall'Europa.
In Nord Africa, che importa attivamente patate da semina dall'Europa, il tipo di accoppiamento A2 è ampiamente rappresentato in quasi tutte le regioni, il che fornisce una possibilità teorica dell'emergere di nuovi genotipi a seguito della ricombinazione sessuale (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Inoltre, in Algeria, si nota la presenza dei genotipi 13_A2, 2_A1 e 23_A1 con una pronunciata dominanza del primo di essi, nonché una graduale diminuzione della proporzione di genotipi unici fino alla completa scomparsa (Rekad et al., 2017). A differenza del resto della regione, in Tunisia (ad eccezione del nord-est del Paese), la popolazione patogena è rappresentata principalmente dal tipo di accoppiamento A1 (Harbaoui et al., 2014).
La linea clonale NA-01 qui è dominante. In generale, la percentuale di linee clonali nella popolazione è solo del 43%. Nell'Africa orientale e meridionale, dove i volumi delle importazioni di semi sono incredibilmente piccoli (Fry et al., 2009), P. infestans è rappresentato solo da due linee clonali di tipo A1, US-1 e KE-1, e la seconda sposta attivamente la prima sulle patate ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Ad oggi, entrambi questi genotipi hanno un notevole numero di variazioni subclonali.
Australia
La prima segnalazione di peronospora sulle patate in Australia risale al 1907 e la prima epifite, presumibilmente causata da forti piogge nei mesi estivi, si verificò nel 1909-1911. (Drenth et al., 2002). In generale, tuttavia, la peronospora non ha un significato economico significativo per il paese. Le epidemie sporadiche di peronospora, provocate da condizioni meteorologiche che forniscono elevata umidità, non si verificano più di una volta ogni 5-7 anni e sono localizzate principalmente nella Tasmania settentrionale e nel Victoria centrale. In relazione a quanto sopra, le pubblicazioni dedicate allo studio della struttura della popolazione australiana di P. infestans sono praticamente assenti. Le ultime informazioni disponibili sono del 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Secondo gli autori, la popolazione dello stato di Victoria era un lignaggio clonale US-1.3, che ha confermato indirettamente la migrazione di questo genotipo dagli Stati Uniti. Gli esemplari della Tasmania sono stati classificati come AU-3, diversi dai genotipi che erano presenti in quel momento in altre parti del mondo.
Caratteristiche dello sviluppo della peronospora in Russia
In Europa, un'infezione introdotta da tuberi da seme malati, oospore che hanno svernato nel terreno, così come la zoosporangia portata dal vento da piante cresciute da tuberi svernati sui campi dell'anno scorso (piante "volontarie"), o su mucchi di quelle abbattute, sono considerate come l'inoculo primario sulle patate. segnalibro per la conservazione dei tuberi. Di questi, le piante coltivate su cumuli di tuberi scartati sono considerate la fonte più pericolosa di infezione. lì, il numero di tuberi germogliati è spesso significativo e la zoosporangia può essere trasportata da loro su lunghe distanze. Il resto delle fonti (oospore, piante "volontarie") non sono così pericolose, perché non è consuetudine coltivare piante negli stessi campi più di una volta ogni 3-4 anni. Anche l'infezione da tuberi malati è minima grazie a un buon sistema di controllo della qualità del seme.
In generale, la quantità di inoculo nelle popolazioni europee è limitata e pertanto l'aumento dell'epidemia è piuttosto lento e può essere controllato con successo utilizzando preparati chimici fungicidi. Il compito principale nelle condizioni europee è la lotta contro l'infezione nella fase in cui inizia la dispersione di massa della zoosporangia dalle piante colpite.
In Russia la situazione è radicalmente diversa. La maggior parte del raccolto di patate e pomodori viene coltivato in piccoli giardini privati; le misure protettive non vengono affatto eseguite su di essi oppure i trattamenti fungicidi vengono eseguiti in un numero insufficiente e iniziano dopo la comparsa della peronospora sulle cime. Di conseguenza, gli orti privati fungono da principale fonte di infezione, da cui la zoosporangia viene trasportata dal vento alle piantagioni commerciali. Ciò è confermato dalle nostre osservazioni dirette nelle regioni di Mosca, Bryansk, Kostroma, Ryazan: il danno alle piante nei giardini privati è stato osservato anche prima dell'inizio dei trattamenti fungicidi delle piantagioni commerciali. Successivamente l'epidemia nei grandi campi è frenata dall'uso di preparati fungicidi, mentre nei giardini privati si assiste ad un rapido sviluppo della peronospora.
In caso di trattamenti impropri o "di bilancio" delle piantagioni commerciali, nei campi compaiono anche focolai di peronospora; successivamente si stanno sviluppando attivamente, coprendo aree sempre più vaste (Elansky, 2015). L'infezione nei giardini privati sta avendo un impatto significativo sulle epidemie nei settori commerciali. In tutte le regioni di coltivazione delle patate della Russia, l'area occupata dalle patate nei giardini privati è molte volte superiore alla superficie totale dei campi dei grandi produttori. In un tale ambiente, gli orti privati possono essere visti come una risorsa globale di inoculo per i campi commerciali. Proviamo a identificare quelle proprietà che sono caratteristiche dei genotipi dei ceppi nei giardini privati.
La semina e il controllo della quarantena di patate da consumo, semi di pomodoro ottenuti da dubbi produttori stranieri, coltivazione a lungo termine di patate e pomodori nelle stesse aree, trattamenti fungicidi impropri o la loro completa assenza portano a gravi epifitosi nel settore privato, il cui risultato è gratuito incrocio, ibridazione e formazione di oospore nei giardini privati. Di conseguenza, si osserva una diversità genotipica molto elevata del patogeno, quando quasi ogni ceppo è unico nel suo genotipo (Elansky et al., 2001, 2015). Piantare patate da semina di varia origine genetica rende improbabile l'emergere di linee clonali specializzate per attaccare una particolare varietà. I ceppi selezionati in questo caso si distinguono per la loro versatilità in relazione alle varietà colpite, la maggior parte di essi ha un numero di geni di virulenza vicino al massimo. Questo è molto diverso dal sistema delle "linee clonali" tipico dei grandi appezzamenti delle aziende agricole con un sistema di protezione contro la peronospora adeguatamente installato. Le "linee clonali" (quando tutti i ceppi dell'agente patogeno della peronospora in campo sono rappresentati da uno o più genotipi) sono onnipresenti nei paesi in cui la coltivazione della patata è svolta esclusivamente da grandi aziende agricole: Stati Uniti, Paesi Bassi, Danimarca, ecc. In Inghilterra, Irlanda, Polonia, dove anche gli appezzamenti domestici sono tradizionalmente diffusi coltivazione della patata, c'è anche una maggiore diversità genotipica nei giardini privati. Alla fine del XX secolo, le "linee clonali" erano diffuse nelle parti asiatiche e dell'Estremo Oriente della Russia (Elansky et al., 20), il che è apparentemente dovuto all'uso delle stesse varietà di patate esclusivamente per la semina. Recentemente, anche la situazione in queste regioni ha cominciato a cambiare verso un aumento della diversità genotipica delle popolazioni.
La mancanza di trattamenti intensivi con preparati fungicidi ha un'altra conseguenza diretta: non c'è accumulo di ceppi resistenti nei giardini. In effetti, i nostri risultati mostrano che i ceppi metalaxil resistenti si trovano significativamente meno frequentemente nei giardini privati rispetto alle piantagioni commerciali.
La stretta vicinanza di piantagioni di patate e pomodori, tipica degli orti privati, facilita la migrazione dei ceppi tra queste colture, per cui, nell'ultimo decennio, tra i ceppi isolati dalle patate, la proporzione di ceppi portatori del gene per la resistenza alle varietà di pomodoro ciliegino (T1), precedentemente caratteristica solo delle ceppi di pomodoro. I ceppi con il gene T1 nella maggior parte dei casi sono altamente aggressivi sia nei confronti delle patate che dei pomodori.
Negli ultimi anni, la peronospora sul pomodoro ha cominciato a comparire in molti casi prima che sulle patate. Le piantine di pomodoro possono essere infestate da oospore nel terreno, o oospore presenti nei semi di pomodoro o aderenti ad esse (Rubin et al., 2001). Negli ultimi 15 anni è comparso nei negozi un gran numero di semi confezionati poco costosi, principalmente importati, al cui utilizzo è passata la maggior parte dei piccoli produttori. I semi possono contenere ceppi con genotipi tipici delle regioni di crescita. In futuro, questi genotipi sono inclusi nel processo sessuale nei giardini privati, il che porta all'emergere di genotipi completamente nuovi.
Si può quindi affermare che gli orti privati sono un “crogiolo” globale, in cui, a seguito dello scambio di materiale genetico, vengono elaborati genotipi esistenti e ne compaiono di completamente nuovi. Inoltre, la loro selezione avviene in condizioni molto diverse da quelle create per le patate nei grandi allevamenti: assenza di pressatura fungicida, uniformità varietale degli impianti, predominanza di piante colpite da varie forme di infezione virale e batterica, vicinanza a pomodori e belladonne selvatiche, incrocio attivo e formazione di oospore, possibilità affinché le oospore agiscano come fonte di infezione per il prossimo anno.
Tutto ciò porta a una diversità genotipica molto elevata delle popolazioni da cortile. Nelle condizioni di epifitosi negli orti, la peronospora si diffonde molto rapidamente e vengono rilasciate enormi quantità di spore, volando verso le piantagioni commerciali vicine. Tuttavia, essendo entrate nei campi commerciali con il corretto sistema di tecnologia agricola e protezione chimica, le spore che sono arrivate non hanno praticamente alcuna possibilità di avviare in campo epifitiche, ciò è dovuto all'assenza di linee clonali resistenti ai fungicidi e specializzate per la varietà coltivata.
Un'altra fonte di inoculo primario può essere costituita da tuberi malati intrappolati in piantine commerciali. Questi tuberi venivano coltivati, di regola, in campi con una buona tecnologia agricola e una protezione chimica intensiva. I genotipi degli isolati che hanno colpito i tuberi sono adattati allo sviluppo della propria varietà. Questi ceppi sono significativamente più pericolosi per la semina commerciale rispetto all'inoculo proveniente da giardini privati. Anche i risultati dei nostri studi supportano questa ipotesi. Le popolazioni isolate da grandi campi con protezione chimica condotta correttamente e una buona tecnologia agricola non differiscono per l'elevata diversità genotipica. Spesso si tratta di diverse linee clonali altamente aggressive.
I ceppi provenienti da materiale di semi commerciale possono entrare nelle popolazioni negli orti e essere coinvolti nei processi in corso in essi. Tuttavia, in un orto, la loro competitività sarà molto più bassa che in un campo commerciale, e presto cesseranno di esistere sotto forma di linea clonale, ma i loro geni potranno essere utilizzati nella popolazione “giardino”.
L'infezione che si sviluppa sulle piante "volontarie" e sui cumuli di tuberi abbattuti durante la raccolta non è così rilevante per la Russia, perché Nelle principali regioni di coltivazione della patata della Russia, si osserva un profondo congelamento del suolo invernale e raramente si sviluppano piante di tuberi che hanno svernato nel terreno. Inoltre, come mostrano i nostri esperimenti, l'agente patogeno della peronospora non sopravvive a temperature negative anche sui tuberi che hanno conservato la loro vitalità. Nella zona arida, dove si pratica la coltivazione delle patate novelle, la peronospora è piuttosto rara a causa della stagione di crescita secca e calda.
Pertanto, stiamo attualmente osservando la divisione delle popolazioni di P. infestans in popolazioni "di campo" e "giardino". Tuttavia, negli ultimi anni, sono stati osservati processi che hanno portato alla convergenza e alla compenetrazione dei genotipi di queste popolazioni.
Tra questi, si può notare un aumento generale dell'alfabetizzazione dei piccoli produttori, l'emergere di piccoli pacchetti di patate da semina a prezzi accessibili, la diffusione di preparati fungicidi in piccoli pacchetti e la perdita della paura della "chimica" da parte della popolazione.
Si verificano situazioni quando, grazie alla vigorosa attività di un fornitore, interi villaggi vengono piantati con tuberi da seme della stessa varietà e dotati di piccole confezioni degli stessi pesticidi. Si può presumere che nelle piantagioni commerciali vicine si troveranno patate della stessa varietà.
D'altra parte, alcune società commerciali di pesticidi stanno promuovendo programmi di trattamento chimico "budget". In questo caso, il numero di trattamenti consigliati è sottostimato e vengono offerti i fungicidi più economici, e l'enfasi non è sulla prevenzione dello sviluppo della peronospora fino allo sfalcio delle cime, ma su un certo ritardo nell'epifitosi per aumentare la resa. Tali programmi sono economicamente giustificati quando si coltivano patate da consumo da semi di bassa qualità, quando in linea di principio non si tratta di ottenere un rendimento elevato. Tuttavia, in questo caso, a differenza delle popolazioni di giardino, il background genetico livellato della patata contribuisce alla selezione di specifiche razze fisiologiche, che sono molto pericolose per questa varietà.
In generale, le tendenze alla convergenza dei metodi di produzione delle patate "orto" e "campo" ci sembrano piuttosto pericolose. Per prevenire le loro conseguenze negative, sia nel settore domestico che in quello commerciale, sarà necessario controllare sia l'assortimento di patate da semina che la gamma di fungicidi offerti ai proprietari privati in piccoli imballaggi, nonché tracciare schemi di protezione delle patate e l'uso di fungicidi nel settore commerciale.
Nelle aree del settore privato, c'è un intenso sviluppo non solo della peronospora, ma anche di Alternaria. La maggior parte dei proprietari di appezzamenti privati non adotta misure speciali per proteggersi dall'Alternaria, scambiando lo sviluppo di Alternaria per l'appassimento naturale delle cime o lo sviluppo della peronospora. Pertanto, con il massiccio sviluppo di Alternaria su varietà sensibili, gli appezzamenti domestici possono servire come fonte di inoculo per le piantagioni commerciali.
Meccanismi di variabilità
Processo di mutazione
Poiché il verificarsi di mutazioni è un processo casuale che procede con una bassa frequenza, il verificarsi di mutazioni in qualsiasi locus dipende dalla frequenza di mutazione di questo locus e dalle dimensioni della popolazione. Quando si studia la frequenza delle mutazioni dei ceppi di P. infestans, viene solitamente determinato il numero di colonie cresciute su terreni nutritivi selettivi dopo il trattamento con mutageni chimici o fisici. Come si può vedere dai dati presentati nella Tabella 8, la frequenza di mutazione dello stesso ceppo in loci diversi può differire di diversi ordini di grandezza. L'elevata frequenza di mutazioni nella resistenza al metalaxil può essere uno dei motivi dell'accumulo di ceppi resistenti ad esso in natura.
La frequenza delle mutazioni spontanee o indotte, calcolata sulla base di esperimenti di laboratorio, non sempre corrisponde ai processi che avvengono nelle popolazioni naturali, per i seguenti motivi:
1. Con fissioni nucleari asincrone, è impossibile stimare la frequenza delle mutazioni per una generazione nucleare. Pertanto, la maggior parte degli esperimenti fornisce informazioni solo direttamente sulla frequenza delle mutazioni, senza distinguere tra due eventi mutazionali e un evento successivo alla mitosi.
2. Le mutazioni a stadio singolo di solito riducono l'equilibrio del genoma, quindi, insieme all'acquisizione di una nuova proprietà, la forma fisica generale dell'organismo diminuisce. La maggior parte delle mutazioni ottenute sperimentalmente hanno una ridotta aggressività e non sono registrate nelle popolazioni naturali. Pertanto, il coefficiente di correlazione tra il grado di resistenza dei mutanti di P. infestans ai fungicidi fenilamide e il tasso di crescita su un terreno artificiale era in media (-0,62), e la resistenza ai fungicidi e l'aggressività sulle foglie di patata (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), che indica la scarsa fitness dei mutanti. Le mutazioni nella resistenza al dimetomorfo sono state anche accompagnate da una forte diminuzione della vitalità (Bagirova et al., 2001).
3. La maggior parte delle mutazioni spontanee e indotte sono recessive e non si manifestano fenotipicamente negli esperimenti, ma costituiscono una riserva nascosta di variabilità nelle popolazioni naturali. I ceppi mutanti isolati in esperimenti di laboratorio portano mutazioni dominanti o semi-dominanti (Kulish e Dyakov, 1979). Apparentemente, la diploidia nucleare spiega i tentativi falliti di ottenere mutanti sotto l'influenza dell'irradiazione UV che sono virulenti su varietà precedentemente resistenti (McKee, 1969). Secondo i calcoli dell'autore, tali mutazioni possono verificarsi con una frequenza inferiore a 1: 500000. La transizione delle mutazioni recessive a uno stato omozigote espresso fenotipicamente può verificarsi a causa della ricombinazione sessuale o asessuata (vedi sotto). Tuttavia, anche in questo caso, la mutazione può essere mascherata dagli alleli dominanti dei nuclei wild-type nel micelio cenotico (multinucleato) e fissata fenotipicamente solo durante la formazione di zoospore mononucleate.
Tabella 8. Frequenza delle mutazioni di P. infestans a sostanze che inibiscono la crescita sotto l'azione della nitrosometilurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Collegamento | Frequenza di mutazione |
Ossitetraciclina | X 6,9 10-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomicina | 8,3 х10-8 |
Tricotecina | X 1,8 10-8 |
Cicloesimide | X 2,1 10-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | X 6,3 10-7 |
Metalaxil | X 6,9 10-6 |
Anche le dimensioni della popolazione giocano un ruolo decisivo nel verificarsi di mutazioni spontanee. In popolazioni molto grandi, in cui il numero di cellule N> 1 / a, dove a è il tasso di mutazione, la mutazione cessa di essere un fenomeno casuale (Kvitko, 1974).
I calcoli mostrano che con un'infestazione media di un campo di patate (35 punti per pianta), si formano giornalmente 8x1012 spore su un ettaro (Dyakov e Suprun, 1984). Apparentemente, tali popolazioni contengono tutte le mutazioni consentite dal tipo di scambio in ciascun locus. Anche una rara mutazione, che si manifesta con una frequenza di 10-9, sarà acquisita da un migliaio di individui su milioni che vivono su un ettaro di un campo di patate. Per le mutazioni che si verificano con una frequenza maggiore (ad esempio, 10-6), in una tale popolazione, possono verificarsi quotidianamente varie mutazioni accoppiate (simultaneamente in due loci), ad es. il processo di mutazione sostituirà la ricombinazione.
Migrazioni
Per P. infestans, sono noti due tipi principali di migrazione: a distanze ravvicinate (all'interno di un campo di patate o campi vicini) diffondendo zoosporangia mediante correnti d'aria o spruzzi di pioggia, e per lunghe distanze - con tuberi piantati o frutti di pomodoro trasportati. Il primo metodo prevede l'espansione del focus della malattia, il secondo - la creazione di nuovi focolai in luoghi lontani dal primario.
La diffusione dell'infezione da tuberi e frutti di pomodoro non solo contribuisce all'emergere della malattia in nuovi luoghi, ma è anche la principale fonte di diversità genetica nelle popolazioni. Nella regione di Mosca vengono coltivate le patate, portate da diverse regioni della Russia e dell'Europa occidentale. I frutti di pomodoro vengono portati dalle regioni meridionali della Russia (Regione di Astrakhan, Territorio di Krasnodar, Caucaso settentrionale). I semi di pomodoro, che possono anche fungere da fonte di infezione (Rubin et al., 2001), vengono importati anche dalle regioni meridionali di Russia, Cina, paesi europei e altri paesi.
Secondo i calcoli di E. Mayr (1974), i cambiamenti genetici in una popolazione locale causati da mutazioni raramente superano 10-5 per locus, mentre nelle popolazioni aperte, lo scambio dovuto al contro flusso di geni è almeno 10-3 - 10-4.
La migrazione nei tuberi infetti è responsabile dell'ingresso di P. infestans in Europa, diffondendosi in tutte le regioni del mondo dove vengono coltivate le patate; hanno causato i cambiamenti più gravi della popolazione. La peronospora sulle patate è apparsa sul territorio dell'Impero russo quasi contemporaneamente alla sua comparsa nell'Europa occidentale.
Poiché la malattia fu notata per la prima volta nel 1846-1847 negli Stati baltici e solo negli anni successivi si diffuse in Bielorussia e nelle regioni nord-occidentali della Russia, la sua origine dell'Europa occidentale è evidente. La prima fonte di peronospora nel Vecchio Mondo non è così ovvia. L'ipotesi sviluppata da Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) suggerisce che il parassita sia arrivato prima dal Messico al Nord America, dove si è diffuso sui raccolti, e poi è stato trasportato in Europa occidentale (fig.7).
A seguito della ripetuta deriva (doppio effetto del "collo di bottiglia"), sono arrivati in Europa singoli cloni, la cui prole ha causato una pandemia in tutto il territorio del Vecchio Mondo, dove si coltivano le patate. A riprova di questa ipotesi, gli autori citano, in primo luogo, la presenza onnipresente di un solo tipo di accoppiamento (A1) e, in secondo luogo, l'omogeneità dei genotipi dei ceppi studiati provenienti da diverse regioni (tutti sono basati su marcatori molecolari, inclusi 2 loci isozimici, pattern di fingerprinting del DNA e la struttura del DNA mitocondriale sono identiche e corrispondono al clone US-1 descritto negli USA). Tuttavia, alcuni dati sollevano dubbi su almeno alcune delle disposizioni dell'ipotesi dichiarata. L'analisi del DNA mitocondriale di P. infestans isolato da campioni di patate da erbario infettati durante il primo periodo epifitotico negli anni 40 ha mostrato che differiscono nella struttura del DNA mitocondriale dal clone US-1, che, quindi, era almeno non l'unica fonte di infezione in Europa (Ristaino et al, 2001).
La situazione della peronospora è nuovamente peggiorata negli anni '80 del XX secolo. Si sono verificate le seguenti modifiche:
1) L'aggressività media della popolazione è aumentata, il che ha portato, in particolare, alla diffusa diffusione della forma più dannosa di peronospora: il danneggiamento dei piccioli e dei fusti.
2) C'è stato un cambiamento nel tempo di comparsa della peronospora sulle patate - da fine luglio all'inizio di luglio e persino alla fine di giugno.
3) Il tipo di accoppiamento A2, che in precedenza era assente nel Vecchio Mondo, è diventato onnipresente.
I cambiamenti sono stati preceduti da due eventi: l'uso massiccio del nuovo fungicida metalaxil (Schwinn e Staub, 1980) e l'emergere del Messico come esportatore mondiale di patate (Niederhauser, 1993). In base a ciò, sono state avanzate due ragioni per i cambiamenti della popolazione: la conversione del tipo di accoppiamento sotto l'influenza del metalaxil (Ko, 1994) e la massiccia introduzione di nuovi ceppi con tuberi infetti dal Messico (Fry e Goodwin, 1995). Sebbene le interconversioni dei tipi di accoppiamento sotto l'influenza del metalaxil siano state ottenute non solo da Ko, ma anche in lavori eseguiti nel laboratorio dell'Università statale di Mosca (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), la seconda ipotesi è preferibile. Insieme alla comparsa del secondo tipo di accoppiamento, si sono verificati gravi cambiamenti nei genotipi dei ceppi russi di P. infestans, inclusi i geni neutri (isozima e loci RFLP), nonché nella struttura del DNA mitocondriale. Il complesso di questi cambiamenti non può essere spiegato dall'azione del metalaxil; piuttosto, c'è stata una massiccia importazione di nuovi ceppi dal Messico, che, essendo più aggressivi (Kato et al., 1997), hanno sostituito i vecchi ceppi (US-1), diventando dominanti nelle popolazioni. Il cambiamento nella composizione delle popolazioni europee è avvenuto in brevissimo tempo - dal 1980 al 1985 (Fry et al., 1992). Sul territorio dell'ex Unione Sovietica, "nuovi ceppi" sono stati trovati in collezioni dall'Estonia nel 1985, cioè prima che in Polonia e Germania (Goodwin et al., 1994). L'ultima volta che il "vecchio ceppo US-1" in Russia è stato isolato da un pomodoro infetto nella regione di Mosca nel 1993 (Dolgova et al., 1997). Anche in Francia, i ceppi "vecchi" sono stati trovati nelle piantagioni di pomodori fino all'inizio degli anni '90, cioè dopo che erano scomparsi da tempo nelle patate (Leberton e Andrivon, 1998). I cambiamenti nei ceppi di P. infestans hanno influenzato molti tratti, compresi quelli di grande importanza pratica, e hanno aumentato la nocività della peronospora.
Ricombinazione sessuale
Affinché la ricombinazione sessuale contribuisca alla variabilità, è necessaria, in primo luogo, la presenza di due tipi di accoppiamento nella popolazione in rapporto prossimo a 1: 1, e, in secondo luogo, la presenza di una variabilità iniziale della popolazione.
Il rapporto tra i tipi di accoppiamento varia notevolmente nelle diverse popolazioni e anche in anni diversi in una popolazione (Tabella 9,10, 90). Le ragioni di tali drastici cambiamenti nella frequenza dei tipi di accoppiamento nelle popolazioni (come, ad esempio, in Russia o in Israele all'inizio degli anni '2002 del secolo scorso) sono sconosciute, ma si ritiene che ciò sia dovuto all'introduzione di cloni più competitivi (Cohen, XNUMX).
Alcuni dati indiretti indicano il corso del processo sessuale in determinati anni e in determinate regioni:
1) Studi su popolazioni della regione di Mosca hanno mostrato che in 13 popolazioni in cui la quota di tipo di accoppiamento A2 era inferiore al 10%, la diversità genetica totale calcolata per tre loci isoenzimatici era 0,08 e in 14 popolazioni in cui la quota di A2 era superiore 30%, la diversità genetica era due volte più alta (0,15) (Elansky et al., 1999). Pertanto, maggiore è la probabilità di rapporti sessuali, maggiore è la diversità genetica della popolazione.
2) La relazione tra il rapporto tra i tipi di accoppiamento nelle popolazioni e l'intensità della formazione di oospore è stata osservata in Israele (Cohen et al., 1997) e in Olanda
(Flier et al., 2004). I nostri studi hanno dimostrato che, nelle popolazioni in cui gli isolati con il tipo di accoppiamento A2 rappresentavano il 62, 17, 9 e 6%, oospore sono state trovate rispettivamente nel 78, 50, 30 e 15% delle foglie di patata analizzate (con 2 o più macchie).
I campioni con 2 o più macchie avevano molte più probabilità di contenere oospore rispetto ai campioni con 1 punto (rispettivamente 32 e 14% dei campioni) (Apryshko et al., 2004).
Le oospore erano molto più comuni nelle foglie dello strato medio e inferiore della pianta di patata (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) In alcune regioni sono stati scoperti genotipi unici, il cui verificarsi è associato alla ricombinazione sessuale. Così, in Polonia nel 1989 e in Francia nel 1990, i ceppi omozigoti per il glucosio-6-
fosfato isomerasi (GPI 90/90). Poiché in precedenza si incontravano solo 10/90 eterozigoti per 100 anni, l'omozigosi è attribuita alla ricombinazione sessuale (Sujkowski et al., 1994). In Colombia (USA), gli isolati che combinano A2 con GPI 100/110 e A1 con GPI 100/100 sono comuni, ma alla fine della stagione 1994 (16 agosto e 9 settembre), ceppi con genotipi ricombinanti (A1 GPI 100/110 e A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) In alcune popolazioni della Polonia (Sujkowski et al., 1994) e del Caucaso settentrionale (Amatkhanova et al., 2004), la distribuzione dei loci del DNA dell'impronta digitale e dei loci della proteina allozima corrisponde alla distribuzione di Hardy-Weinberg, che indica
sull'elevata quota del contributo della ricombinazione sessuale alla variabilità delle popolazioni. In altre regioni della Russia, non è stata trovata alcuna corrispondenza con la distribuzione di Hardy-Weinberg nelle popolazioni, ma è stata dimostrata la presenza di linkage disequilibrium, indicando la predominanza della riproduzione clonale (Elansky et al., 1999).
5) La diversità genetica (GST) tra ceppi con diversi tipi di accoppiamento (A1 e A2) era inferiore a quella tra popolazioni diverse (Sujkowski et al., 1994), che indica indirettamente incroci sessuali.
Allo stesso tempo, il contributo della ricombinazione sessuale alla diversità della popolazione non può essere molto alto. Questo contributo è stato calcolato per le popolazioni della regione di Mosca (Elansky et al., 1999). Secondo i calcoli di Lewontin (1979), "la ricombinazione, che può produrre nuove varianti da due loci con una frequenza non superiore al prodotto delle loro eterozigosità, diventa efficace solo se i valori di eterozigosi per entrambi gli alleli sono già alti".
Con il rapporto tra i due tipi di accoppiamento, tipico della regione di Mosca, pari a 4: 1, la frequenza di ricombinazione sarà 0,25. La probabilità che i ceppi incrociati siano eterozigoti per due dei tre loci isoenzimatici studiati nelle popolazioni studiate è stata 0,01 (2 ceppi su 177). Pertanto, la probabilità di occorrenza di doppi eterozigoti come risultato della ricombinazione non deve superare il loro prodotto moltiplicato per la probabilità di attraversamento (0,25x0,02x0,02) = 10-4, ad es. i ricombinanti sessuali di solito non rientrano nel campione studiato di ceppi. Questi calcoli sono stati effettuati per le popolazioni della regione di Mosca caratterizzate da una variabilità relativamente elevata. Nelle popolazioni monomorfiche come quelle siberiane, il processo sessuale, anche se avviene in singole popolazioni, non può influenzare la loro diversità genetica.
Inoltre, P. infestans è caratterizzato da frequenti disallineamenti cromosomici nella meiosi, che porta ad aneuploidia (Carter et al., 1999). Tali violazioni riducono la fertilità degli ibridi.
Ricombinazione parasessuale, conversione genica mitotica
In esperimenti sulla fusione di ceppi di P. infestans con mutazioni di resistenza a diversi inibitori della crescita, è stata riscontrata l'emergenza di misolati resistenti a entrambi gli inibitori (Shattock e Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). I ceppi resistenti a due inibitori della crescita sono sorti come risultato dell'eterocariotizzazione del micelio, e in questo caso si sono spaccati durante la riproduzione da zoospore mononucleari (Judelson, Ge Yang, 1998), o non si sono fenduti nella prole monozoospora, perché avevano nuclei tetraploidi (poiché gli isolati iniziali sono diploidi) (K , 1979). I diploidi eterozigoti segregavano a una frequenza molto bassa a causa dell'aploidizzazione, della non disgiunzione cromosomica e dell'incrocio mitotico (Poedinok et al., 1982). La frequenza di questi processi potrebbe essere aumentata con l'aiuto di determinate azioni sui diploidi eterozigoti (ad esempio, l'irradiazione UV delle spore germinanti).
Sebbene la formazione di ibridi vegetativi con doppia resistenza avvenga non solo in vitro, ma anche nei tuberi di patata infettati con una miscela di mutanti (Kulish et al., 1978), è piuttosto difficile valutare il ruolo della ricombinazione parasessuale nella generazione di nuovi genotipi nelle popolazioni. La frequenza della formazione di segreganti dovuta all'aploidizzazione, alla non disgiunzione dei cromosomi e all'incrocio mitotico senza effetti speciali è trascurabile (inferiore a 10-3).
L'emergenza di segreganti omozigoti di ceppi eterozigoti può essere basata sia sull'incrocio mitotico che sulla conversione genica mitotica, che in P. sojae si verifica con una frequenza da 3 x 10-2 a 5 x 10-5 per locus, a seconda del ceppo (Chamnanpunt et al. , 2001).
Sebbene la frequenza di occorrenza di eterocarioni e diploidi eterozigoti si sia rivelata inaspettatamente alta (raggiungendo le decine di percento), questo processo si verifica solo quando le colture mutanti ottenute dallo stesso ceppo vengono unite. Quando si utilizzano diversi ceppi isolati dalla natura, l'eterocariotizzazione non si verifica (o si verifica con una frequenza molto bassa) a causa della presenza di incompatibilità vegetativa (Poedinok e Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Di conseguenza, il ruolo della ricombinazione parasessuale può essere ridotto solo alla ricombinazione intraclonale nei nuclei eterozigoti e alla transizione dei singoli geni a uno stato omozigote senza un processo sessuale. Questo processo può avere un significato epidemiologico nei ceppi con mutazioni recessive o semi-dominanti da resistenza ai fungicidi. La sua transizione a uno stato omozigote a causa del processo parasessuale aumenterà la resistenza del portatore della mutazione (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgressione dei geni
Le specie eterotalliche Phytophthora sono in grado di incrociarsi con la formazione di oospore ibride (vedere Vorob'eva e Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). L'ibrido naturale delle due specie Phytophthora era così aggressivo da uccidere migliaia di ontani nel Regno Unito (Brasier et al., 1999). P. infestans può essere presente con altre specie del genere (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, ecc.) Su piante ospiti comuni e nel suolo, ma in letteratura ci sono poche informazioni sulla possibilità di ibridi interspecifici. In condizioni di laboratorio, sono stati ottenuti ibridi tra P. infestans e P. Mirabilis (Goodwin e Fry, 1994).
Tabella 9. La proporzione di ceppi di P. infestans con tipo di accoppiamento A2 in diversi paesi del mondo nel periodo dal 1990 al 2000 (secondo i dati di fonti e siti di letteratura aperta www.euroblight.net, www.eucablight.org)
paese | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bielorussia | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgio | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Inghilterra | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlandia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francia | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungheria | 72 (32) | ||||||||||
Irlanda | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irlanda | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Paesi Bassi | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norvegia | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Perù | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polonia | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Scozia | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Svezia | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Galles | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Corea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
porcellana | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marocco | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Serbia | 76 (37) | ||||||||||
Messico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabella 10. La proporzione di ceppi di P. infestans con tipo di accoppiamento A2 in diversi paesi del mondo nel periodo dal 2000 al 2011
paese | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Bielorussia | 42 (78) | ||||||||||
Belgio | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Svizzera | 89 (19) | ||||||||||
Repubblica Ceca | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Germania | 95 (53) | ||||||||||
Danimarca | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Inghilterra | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlandia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francia | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungheria | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irlanda | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Paesi Bassi | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norvegia | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Perù | 0 (36) | ||||||||||
Polonia | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Scozia | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Svezia | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovacchia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Galles | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Corea | 46 (26) | ||||||||||
Brasile | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
porcellana | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamica della composizione genotipica delle popolazioni
Cambiamenti nella composizione genotipica delle popolazioni di P. infestans possono verificarsi sotto l'influenza della migrazione di nuovi cloni da altre regioni, delle pratiche agricole (cambio di varietà, applicazione di fungicidi) e delle condizioni meteorologiche. Le influenze esterne influenzano in modo diverso i cloni nelle diverse fasi del ciclo di vita; pertanto, le popolazioni sperimentano annualmente cambiamenti ciclici nelle frequenze dei geni soggetti a selezione, a causa di un cambiamento nel ruolo dominante della deriva e della selezione genica.
Influenza della varietà
Nuove cultivar con geni efficaci per la resistenza verticale (geni R) sono un potente fattore selettivo che seleziona cloni con geni di virulenza complementari nelle popolazioni di P. infestans. In assenza di resistenza aspecifica nella varietà di patate che inibisce la crescita della popolazione patogena, il processo di sostituzione dei cloni dominanti nella popolazione avviene molto rapidamente. Quindi, dopo la diffusione nella regione di Mosca della varietà Domodedovsky, che ha il gene di resistenza R3, la frequenza dei cloni virulenti per questa varietà è aumentata da 0,2 a 0,82 in un anno (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Tuttavia, il cambiamento nelle frequenze dei geni di virulenza (patotipi) nelle popolazioni si verifica non solo sotto l'influenza delle varietà di patate coltivate. Ad esempio, in Bielorussia fino al 1977, dominavano i cloni con geni di virulenza 1 e 4, causati dalla coltivazione di varietà di patate con geni di resistenza R1 e R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Tuttavia, alla fine degli anni '70 del XX secolo, sono comparsi cloni con geni di virulenza diversi e loro combinazioni, ei geni di resistenza complementare non sono mai stati utilizzati nell'allevamento di patate (geni extra virulenza) (Ivanyuk et al., 2002). La ragione della comparsa di tali cloni, a quanto pare, è dovuta alla migrazione in Europa di materiale infettivo dal Messico con tuberi di patata. A casa, questi cloni si sono sviluppati non solo su patate coltivate, ma anche su specie selvatiche portatrici di una varietà di geni di resistenza; pertanto, la combinazione di molti geni di virulenza nel genoma era necessaria per la sopravvivenza in quelle condizioni.
Quanto alle varietà a resistenza aspecifica, esse, riducendo il tasso di riproduzione dell'agente patogeno, ritardano l'evoluzione delle sue popolazioni, che, come già accennato, è funzione del numero. Poiché l'aggressività è poligenica, i cloni contenenti un numero maggiore di geni per l '"aggressività" si accumulano quanto prima maggiore è la dimensione della popolazione. Pertanto, le razze altamente aggressive non sono un prodotto dell'adattamento a varietà coltivate con resistenza aspecifica, ma, al contrario, hanno maggiori probabilità di essere rilevate nelle piantagioni di varietà altamente sensibili che sono accumulatori delle spore del parassita.
Pertanto, in Russia, le popolazioni più aggressive di P. Infestans sono state trovate in zone di epifite annuali (popolazioni delle regioni di Sakhalin, Leningrado e Bryansk). L'aggressività di queste popolazioni si è rivelata superiore a quella di quelle messicane (Filippov et al., 2004).
Inoltre, nelle foglie delle varietà resistenti si formano meno oospore rispetto a quelle sensibili (Hanson e Shattock, 1998), ovvero la resistenza aspecifica della varietà riduce anche le capacità di ricombinazione del parassita e la possibilità di metodi di svernamento alternativi.
Influenza di fungicidi
I fungicidi non solo riducono il numero di funghi fitopatogeni, ad es. influenzano le caratteristiche quantitative delle loro popolazioni, ma possono anche modificare le frequenze dei singoli genotipi, ad es. influenzano la composizione qualitativa delle popolazioni. Tra gli indicatori più importanti delle popolazioni che cambiano sotto l'influenza di fungicidi sono i seguenti: cambiamenti nella resistenza ai fungicidi, cambiamenti nell'aggressività e virulenza e cambiamenti nei sistemi di riproduzione.
Influenza dei fungicidi sulla resistenza e aggressività delle popolazioni
Il grado di questa influenza è determinato, prima di tutto, dal tipo di fungicida utilizzato, che può essere condizionatamente suddiviso in polysite, oligosite e monosite.
Il primo include la maggior parte dei fungicidi da contatto. La resistenza a loro (se è possibile affatto) è controllata da un gran numero di geni molto debolmente espressivi. Queste proprietà determinano l'assenza di cambiamenti visibili nella resistenza della popolazione dopo il trattamento con fungicidi (sebbene in alcuni esperimenti sia stato ottenuto un certo aumento della resistenza). La popolazione fungina conservata dopo l'irrorazione con fungicidi da contatto è costituita da due gruppi di ceppi:
1) Ceppi conservati in aree di piante non trattate con il farmaco. Non essendoci contatto con il fungicida, l'aggressività e la resistenza di questi ceppi non cambia.
2) Ceppi a contatto con il fungicida, la cui concentrazione nei punti di contatto era inferiore a quella letale. Come accennato in precedenza, anche la resistenza di questa parte della popolazione non cambia, tuttavia, a causa del parziale effetto dannoso del fungicida anche in concentrazione subletale sul metabolismo della cellula fungina, la forma fisica generale e la sua componente parassitaria, l'aggressività, diminuiscono (Derevyagina e Dyakov, 1990).
Pertanto, anche una parte della popolazione che non è morta, esposta al contatto con il fungicida, ha una debole aggressività e non può essere fonte di epifitosi. Pertanto, un trattamento accurato che riduce la frequenza della proporzione di popolazione non a contatto con il fungicida è una condizione per il successo delle misure protettive. La resistenza ai fungicidi oligositi è controllata da diversi geni additivi.
La mutazione di ciascun gene porta a un certo aumento della resistenza e il grado complessivo di resistenza è dovuto all'aggiunta di tali mutazioni. Pertanto, l'aumento della resistenza avviene gradualmente. Un esempio di aumento graduale della resistenza sono le mutazioni nella resistenza al fungicida dimetomorfo, ampiamente utilizzato per proteggere le patate dalla peronospora. La resistenza al dimetomorfo è poligenica e additiva. Una mutazione in una fase aumenta leggermente la resistenza.
Ogni successiva mutazione riduce la dimensione del target e, di conseguenza, la frequenza delle mutazioni successive (Bagirova et al., 2001). L'aumento della resistenza media della popolazione dopo ripetuti trattamenti con il fungicida oligosite avviene gradualmente e gradualmente. La velocità di questo processo è determinata da almeno tre fattori: la frequenza di mutazione dei geni di resistenza, il coefficiente di resistenza (il rapporto tra la dose letale di un ceppo resistente rispetto a uno sensibile) e l'effetto delle mutazioni nei geni di resistenza sulla forma fisica.
L'incidenza di ogni successiva mutazione è inferiore alla precedente, quindi il processo ha una natura smorzante (Bagirova et al., 2001). Tuttavia, se in una popolazione si verificano processi di ricombinazione (sessuale o parasessuale), è possibile combinare diverse mutazioni parentali in un ceppo ibrido e accelerare il processo. Pertanto, le popolazioni di panmix acquisiscono resistenza più velocemente di quelle agamiche, e in queste ultime, le popolazioni che non hanno barriere di incompatibilità vegetativa più velocemente delle popolazioni divise da tali barriere. A questo proposito, la presenza di ceppi nelle popolazioni che differiscono nei tipi di accoppiamento accelera il processo di acquisizione della resistenza ai fungicidi oligositi.
Il secondo e il terzo fattore non contribuiscono al rapido accumulo di ceppi resistenti al dimetomorfo nelle popolazioni. Ogni successiva mutazione raddoppia approssimativamente la resistenza, che è insignificante, e allo stesso tempo riduce sia il tasso di crescita in un ambiente artificiale sia l'aggressività (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Forse è per questo che non ci sono praticamente ceppi resistenti tra i ceppi naturali di P. infestans, anche quelli raccolti da piantagioni di patate trattate con dimetomorfo.
Una popolazione trattata con un fungicida oligosite sarà anche composta da due gruppi di ceppi: quelli che non sono stati a contatto con il fungicida, e quindi non hanno modificato le caratteristiche iniziali (se in questo gruppo si trovano ceppi resistenti, non si accumuleranno a causa della maggiore aggressività e competitività dei ceppi sensibili), e ceppi a contatto con concentrazioni subletali del fungicida. È tra questi ultimi che è possibile l'accumulo di ceppi resistenti, perché qui hanno vantaggi rispetto a quelli sensibili.
Pertanto, quando si utilizzano fungicidi oligositi, non è tanto un trattamento completo che è importante quanto un'elevata concentrazione del farmaco, molte volte superiore alla dose letale, perché con la mutagenesi graduale, la resistenza iniziale dei ceppi mutati è bassa.
Infine, le mutazioni nella resistenza ai fungicidi monositi sono altamente espressive, cioè una mutazione può segnalare un alto livello di resistenza, fino alla completa perdita di sensibilità. Pertanto, l'aumento della resistenza delle popolazioni avviene molto rapidamente.
Un esempio di tali fungicidi sono le fenilammidi, compreso il più comune fungicida metalaxile. Mutazioni di resistenza si verificano con un'alta frequenza e il grado di resistenza nei mutanti è molto alto: supera il ceppo sensibile di un fattore di mille o più (Derevyagina et al., 1993). Sebbene il tasso di crescita e l'aggressività dei mutanti resistenti diminuiscano sullo sfondo della morte di ceppi sensibili da un fungicida sistemico, il numero della popolazione resistente sta crescendo rapidamente e la sua aggressività sta aumentando parallelamente. Pertanto, dopo diversi anni di utilizzo del fungicida, l'aggressività dei ceppi resistenti può non solo eguagliare l'aggressività di quelli sensibili, ma anche superarla (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Effetto sulla ricombinazione sessuale
Poiché la frequente presenza del tipo di accoppiamento A2 nelle popolazioni di P. infestans coincideva con l'uso intensivo di metalaxil contro la peronospora, si è ipotizzato che il metalaxil inducesse la conversione del tipo di accoppiamento. In P. parasitica, una tale conversione sotto l'azione di Chloroneb e metalaxyl è stata provata sperimentalmente (Ko, 1994). Un singolo passaggio su un terreno con una bassa concentrazione di metalaxil ha portato alla comparsa di isolati omotallici da un ceppo di P. infestans sensibile al metalaxile con accoppiamento di tipo A1 (Savenkova e Cherepnikova-Anikina, 2002). Durante i passaggi successivi su terreni con una maggiore concentrazione di metalaxile, non è stato rilevato un singolo isolato del tipo di accoppiamento A2, tuttavia, la maggior parte degli isolati, quando incrociati con isolati A2, invece di oospore, formavano brutti accumuli di micelio ed erano sterili. I passaggi di un ceppo resistente avente il tipo di accoppiamento A2 su terreni con un'alta concentrazione di metalaxile ci hanno permesso di rilevare tre forme di cambiamenti del tipo di accoppiamento: 1) completa sterilità quando incrociato con isolati A1 e A2; 2) omotallismo (la formazione di oospore in monocoltura); 3) conversione del tipo di accoppiamento A2 in A1. Pertanto, il metalaxile può causare cambiamenti nei tipi di accoppiamento nelle popolazioni di P. infestans e, di conseguenza, la ricombinazione sessuale in esse.
Influenza sulla ricombinazione vegetativa
Alcuni geni di resistenza agli antibiotici hanno aumentato la frequenza dell'eterocariotizzazione ifale e della diploidizzazione nucleare (Poedinok e Dyakov, 1981). Come notato in precedenza, l'eterocariotizzazione delle ife durante la fusione di diversi ceppi di P. infestans si verifica molto raramente a causa del fenomeno di incompatibilità vegetativa in questo fungo. Tuttavia, i geni per la resistenza ad alcuni antibiotici possono avere effetti collaterali, espressi nel superamento dell'incompatibilità vegetativa. Questa proprietà era posseduta dal gene di resistenza alla streptomicina mutante 1S-1. La presenza di tali mutanti nelle popolazioni di campo di phytophthora può aumentare il flusso di geni tra i ceppi e accelerare l'adattamento dell'intera popolazione a nuove varietà o fungicidi.
Alcuni fungicidi e antibiotici possono influenzare la frequenza della ricombinazione mitotica, che può anche alterare le frequenze genotipiche nelle popolazioni. Il fungicida benomyl ampiamente utilizzato si lega alla beta-tubulina, una proteina da cui sono costruiti i microtubuli del citoscheletro, e quindi interrompe i processi di separazione cromosomica nell'anafase della mitosi, aumentando la frequenza della ricombinazione mitotica (Hastie, 1970).
Il fungicida para-fluorofenilalanina, usato per trattare la malattia olandese degli olmi, ha la stessa proprietà. La para-fluorofenilalanina ha aumentato la frequenza di ricombinazione nei diploidi eterozigoti P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cambiamenti ciclici nella composizione genotipica delle popolazioni nel ciclo di vita di P. infestans
Il ciclo di sviluppo classico di P. infestans nella zona temperata si compone di 4 fasi.
1) Fase di crescita esponenziale della popolazione (fase policiclica) con generazioni brevi. Questa fase di solito inizia a luglio e dura 1,5-2 mesi.
2) La fase di arresto della crescita della popolazione a causa di una forte diminuzione della proporzione di tessuto non colpito o dell'insorgenza di condizioni meteorologiche sfavorevoli. Questa fase negli allevamenti che effettuano la rimozione anticipata delle foglie prima della raccolta esce dal ciclo annuale.
3) La fase di svernamento nei tuberi, accompagnata da una significativa diminuzione delle dimensioni della popolazione a causa dell'infezione accidentale dei tuberi, del lento sviluppo dell'infezione in essi, dell'assenza di reinfezione dei tuberi, della decomposizione e dell'abbattimento dei tuberi colpiti in normali condizioni di conservazione.
4) La fase di lento sviluppo nel suolo e sulle piantine (fase monociclica), in cui la durata della generazione può raggiungere un mese o più (fine maggio - inizio luglio). Di solito in questo momento, le foglie malate sono difficili da rilevare anche con osservazioni speciali.
Fase di crescita esponenziale della popolazione (fase policiclica)
Numerose osservazioni (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) hanno mostrato che all'inizio dell'epifitotia predominano cloni poco virulenti e leggermente aggressivi, che vengono successivamente sostituiti da quelli più virulenti e aggressivi. il tasso di crescita dell'aggressività della popolazione è tanto maggiore quanto meno resistente è la varietà della pianta ospite.
Man mano che la popolazione cresce, aumenta la concentrazione di entrambi i geni selettivamente importanti introdotti nelle varietà commerciali (R1-R4) e selettivamente neutri (R5-R11). Quindi, nelle popolazioni vicino a Mosca nel 1993, la virulenza media da fine luglio a metà agosto è aumentata da 8,2 a 9,4 e l'aumento maggiore è stato osservato per il gene di virulenza selettivamente neutro R5 (dal 31 all'86% dei cloni virulenti) (Smirnov, 1996 ).
Una diminuzione del tasso di crescita di una popolazione è accompagnata da una diminuzione dell'attività parassitaria della popolazione. Pertanto, negli anni depressivi, sia il numero totale di razze che la proporzione di razze altamente virulente sono inferiori rispetto a quelli epifitotici (Borisenok, 1969). Se al culmine dell'epifitosi le condizioni meteorologiche diventano sfavorevoli per la peronospora e l'infestazione da patate diminuisce, diminuisce anche la concentrazione di cloni altamente virulenti e aggressivi (Rybakova et al., 1987).
L'aumento delle frequenze dei geni che influenzano la virulenza e l'aggressività della popolazione può essere dovuto alla selezione di cloni più virulenti e aggressivi nella popolazione mista. Per dimostrare la selezione, è stato sviluppato un metodo per l'analisi delle mutazioni neutre, che è stato utilizzato con successo nelle popolazioni chemostatiche di lievito (Adams et al., 1985) e Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
La frequenza dei mutanti resistenti alla blasticidina S nella popolazione di campo di P. infestans è diminuita parallelamente alla crescita dell'aggressività della popolazione, il che indica un cambiamento nei cloni dominanti nel processo di crescita della popolazione (Rybakova et al., 1987).
Fase di svernamento nei tuberi
Durante lo svernamento nei tuberi di patata, la virulenza e l'aggressività dei ceppi di P. infestans diminuiscono e la diminuzione della virulenza avviene più lentamente dell'aggressività (Rybakova e Dyakov, 1990). Apparentemente, in condizioni favorevoli alla rapida crescita della dimensione della popolazione (selezione r), sono utili geni di virulenza "extra" e alta aggressività, quindi lo sviluppo di epifitosi è accompagnato dalla selezione dei cloni più virulenti e aggressivi. In condizioni di saturazione dell'ambiente, quando non il tasso di riproduzione, ma la persistenza dell'esistenza in condizioni sfavorevoli (selezione K) gioca un ruolo importante, i geni "extra" di virulenza e aggressività riducono la forma fisica, ei cloni con questi geni sono i primi a morire, in modo che l'aggressività media e la virulenza della popolazione sta diminuendo.
Fase di vegetazione nel suolo
Questa fase è la più misteriosa del ciclo di vita (Andrivon, 1995). La sua esistenza è stata postulata in modo puramente speculativo - a causa della mancanza di informazioni su ciò che accade all'agente patogeno per un lungo periodo (a volte più di un mese) - dall'emergere delle piantine di patate alla comparsa delle prime macchie della malattia su di esse. Sulla base di osservazioni ed esperimenti, è stato ricostruito il comportamento del fungo in questo periodo della vita (Hirst e Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
La sporulazione del fungo può formarsi sui tuberi infetti nel terreno. Le spore risultanti germinano con ife, che possono vegetare a lungo nel terreno. Le spore primarie (formate sui tuberi) e secondarie (sul micelio nel terreno) salgono alla superficie del suolo dalle correnti capillari, ma acquisiscono la capacità di infettare le patate solo dopo che le sue foglie inferiori scendono ed entrano in contatto con la superficie del suolo. Tali foglie (vale a dire, le prime macchie della malattia si trovano su di esse) non si formano immediatamente, ma dopo una crescita e uno sviluppo prolungati delle cime delle patate.
Pertanto, la fase di vegetazione saprotrofica può esistere anche nel ciclo vitale di P. infestans. Se nella fase parassitaria del ciclo di vita l'aggressività è la componente più importante del fitness, allora nella fase saprotrofica la selezione è finalizzata alla riduzione delle proprietà parassitarie, come è stato dimostrato sperimentalmente per alcuni funghi fitopatogeni (vedi Carson, 1993). Pertanto, in questa fase del ciclo, le proprietà aggressive dovrebbero essere perse più intensamente. Ma finora non sono stati effettuati esperimenti diretti per confermare le ipotesi di cui sopra.
I cambiamenti stagionali influenzano non solo le proprietà patogene di P. infestans, ma anche la resistenza ai fungicidi, che cresce nella fase policiclica (durante le epifitotie), e diminuisce durante la conservazione invernale (Derevyagina et al., 1991; Kadish e Cohen, 1992). Un calo particolarmente intenso della resistenza al metalaxil è stato osservato nel periodo compreso tra la messa a dimora dei tuberi colpiti e la comparsa delle prime macchie della malattia in campo.
Specializzazione intraspecifica e sua evoluzione
P. infestans sta causando epidemie in due colture commercialmente importanti, patate e pomodoro. Le epifitotie sulle patate sono iniziate subito dopo che il fungo è entrato in nuove aree. La sconfitta del pomodoro è stata notata anche poco dopo la comparsa dell'infezione sulle patate, ma le epifitosi sul pomodoro sono state notate solo un centinaio di anni dopo, a metà del XNUMX ° secolo. Ecco cosa scrivono Hallegli e Niederhauser sulla sconfitta dei pomodori negli USA
(1962): “Per circa 100 anni dopo la grave epifitosi del 1845, furono fatti pochi o quasi nessun tentativo di ottenere varietà resistenti di pomodoro. Sebbene la peronospora sia stata registrata per la prima volta sui pomodori già nel 1848, non divenne oggetto di seria attenzione da parte degli allevatori di questa pianta fino a quando una forte epidemia della malattia nel 1946. Sul territorio della Russia la peronospora del pomodoro fu registrata nel 60esimo secolo. “Per molto tempo i ricercatori non hanno prestato attenzione a questa malattia, poiché non ha causato danni economici significativi. Ma negli anni '70 e '1979. Epifite del XX secolo di peronospora sul pomodoro sono state osservate in Unione Sovietica, principalmente nella regione del Basso Volga, Ucraina, Caucaso settentrionale, Moldova ... ”(Balashova, XNUMX).
Da allora, la peronospora del pomodoro è diventata annuale, diffusa in tutto il territorio di coltivazione industriale e domestica e causa enormi danni economici a questa coltura. Quello che è successo? Perché la prima comparsa del parassita sulle patate e la lesione epifitotica di questa coltura si sono verificate quasi contemporaneamente, e perché è passato un secolo prima che l'epifitosi comparisse sul pomodoro? Queste differenze supportano una fonte di infezione messicana piuttosto che sudamericana. Se la specie Phytophthora infestans si è formata come parassita di specie portatrici di tuberi messicani del genere Solanum, allora è comprensibile perché le patate coltivate appartenenti alla stessa sezione del genere delle specie messicane siano state così fortemente colpite, ma a causa dell'assenza di coevoluzione con il parassita, che non ha sviluppato meccanismi di resistenza specifica e aspecifica.
Il pomodoro appartiene ad una sezione diversa del genere, il tipo del suo scambio presenta differenze significative rispetto alla specie tuberosa, quindi, nonostante il pomodoro non sia al di fuori della specializzazione alimentare di P. infestans, l'intensità della sua sconfitta è stata insufficiente per gravi perdite economiche.
La comparsa di epifitosi su un pomodoro è dovuta a gravi cambiamenti genetici nel parassita, che hanno aumentato la sua forma fisica (patogenicità) durante il parassitismo. Riteniamo che la nuova forma specializzata per la parassitizzazione del pomodoro sia la razza T1 descritta da M. Gallegly, che colpisce varietà di pomodorini (Red Cherry, Ottawa), resistenti alla razza T0 diffusa sulle patate (Gallegly, 1952). Apparentemente, una mutazione (o una serie di mutazioni) che ha trasformato la razza T0 nella razza T1 e ha portato alla comparsa di cloni altamente adattati per sconfiggere il pomodoro. Come spesso accade, un aumento della patogenicità per un ospite è stato accompagnato da una diminuzione di esso per un altro, cioè è sorta una specializzazione intraspecifica iniziale, non ancora completa - alle patate (razza T0) e al pomodoro (razza T1).
Qual è la prova di questa ipotesi?
- Evento su patate e pomodori. Sulle foglie di pomodoro predomina la razza T1, mentre sulle foglie di patata è rara. Secondo S.F.Bagirova e T.A. Oreshonkova (non pubblicato) nella regione di Mosca nel 1991-1992, il verificarsi della gara T1 nelle piantagioni di patate era dello 0% e nelle piantagioni di pomodori - 100%; nel 1993-1995 - 33% e 90%, rispettivamente; nel 2001 - 0% e 67%. Dati simili sono stati ottenuti in Israele (Cohen, 2002). Esperimenti con l'infezione di tuberi di patata con isolati della razza T1 e una miscela di isolati T0 e T1 hanno mostrato che gli isolati della razza T1 sono scarsamente conservati nei tuberi e sono sostituiti da isolati della razza T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamica della razza T1 nelle piantagioni di pomodori. L'infezione primaria delle foglie di pomodoro viene effettuata da isolati della razza T0, che dominano nell'analisi dell'infezione nelle prime macchie formate sulle foglie. Ciò conferma lo schema generalmente accettato della migrazione del parassita: la massa principale di infezione da patate è costituita dalla razza T0, tuttavia, un piccolo numero di cloni T1 conservati nelle patate, una volta sul pomodoro, spiazza la razza T0 e si accumula verso la fine del periodo epifitico. È anche possibile che esista una fonte alternativa di infezione delle foglie di pomodoro con la razza T1, non potente come i tuberi e le foglie di patata, ma costante. Pertanto, questa fonte ha un debole effetto sulla struttura genetica della popolazione che infetta il pomodoro, ma successivamente determina l'accumulo della razza T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Aggressività verso patate e pomodori. L'infezione artificiale di pomodoro e foglie di patata con isolati di razze T0 e T1 ha mostrato che i primi sono più aggressivi per le patate che per il pomodoro, e i secondi sono più aggressivi per il pomodoro che per la patata. Queste differenze si manifestano nello spostamento di isolati di una razza non "propria" da una popolazione mista durante i passaggi sulle foglie in una serra (Dyakov et al., 1975) e nelle parcelle (Leberton et al., 1999); differenze nel carico infettivo minimo, periodo di latenza, dimensione delle macchie infettive e produzione di spore (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al., al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
L'aggressività degli isolati della razza T1 nei confronti di cultivar di pomodoro prive di geni di resistenza è così elevata che questi isolati spore sulle foglie come su un mezzo nutritivo senza necrotizzare il tessuto infetto (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulenza per patate e pomodori. La razza T1 colpisce le varietà di pomodorini con il gene di resistenza Ph1, mentre la razza T0 non è in grado di infettare queste varietà, ad es. ha una virulenza più stretta. In relazione ai differenziatori
I geni R delle patate sono inversamente correlati, ad es. i ceppi isolati dalle foglie di pomodoro sono meno virulenti dei ceppi di "patata" (Tabella 11).
5) Marcatori neutri. Anche l'analisi di marker neutri nelle popolazioni di P. infestans parassitizzante su patate e pomodori testimonia la selezione intraspecifica multidirezionale. Nelle popolazioni brasiliane di P. infestans, gli isolati di foglie di pomodoro appartenevano alla linea clonale US-1 e quelli di foglie di patata appartenevano alla linea BR-1 (Suassuna et al., 2004). In Florida (USA), dal 1994, il clone US-90 ha iniziato a dominare sulle patate (con una presenza di oltre il 8%), e i cloni US-11 e US-17 sul pomodoro, e gli isolati di quest'ultimo sono più aggressivi per il pomodoro che per la patata (Weingartner , Tombolato, 2004). Differenze significative nelle frequenze genotipiche (impronte digitali del DNA) negli isolati di patata e pomodoro sono state stabilite per 1200 ceppi di P. infestans raccolti negli Stati Uniti dal 1989 al 1995 (Deahl et al., 1995).
Utilizzando il metodo AFLP è stato possibile separare 74 ceppi raccolti da foglie di patate e pomodori nel 1996-1997. in Francia e Svizzera, in 7 gruppi. I ceppi di patata e pomodoro non differivano chiaramente, ma i ceppi di "patata" erano geneticamente più diversi di quelli di "pomodoro". I primi sono stati trovati in tutti e sette i cluster e il secondo solo in quattro, il che indica un genoma più specializzato del secondo (Knapova e Gisi, 2002).
6) Meccanismi di isolamento. Se le popolazioni del parassita su due specie di piante ospiti evolvono verso il restringimento della specializzazione verso il proprio ospite, allora sorgono vari meccanismi pre e postmeiotici che impediscono gli scambi genetici di interpopolazione (Dyakov e Lekomtseva, 1984).
Diversi studi hanno indagato l'influenza della fonte dei ceppi parentali sull'efficienza dell'ibridazione. Quando ceppi isolati da specie diverse del genere Solanum sono stati incrociati in Ecuador (Oliva et al., 2002), è stato riscontrato che i ceppi con il tipo di accoppiamento A2 da belladonne selvatiche (linea clonale EC-2) hanno incrociato il peggio con i ceppi di pomodoro (linea EC -3) e incrociato più efficacemente con il ceppo di patate (EC-1).
Tutti gli ibridi sono risultati non patogeni. Gli autori ritengono che la bassa percentuale di ibridazione e la riduzione della patogenicità negli ibridi siano dovute a meccanismi postmeiotici di isolamento riproduttivo delle popolazioni.
Negli esperimenti di Bagirova et al. (1998), un gran numero di ceppi di patate e pomodori sono stati incrociati con le proprietà delle razze T0 e T1. Gli incroci più altamente fertili di ceppi T1xT1 isolati dal pomodoro (36 oospore nel campo visivo del microscopio, 44% di germinazione oospora), i meno efficaci erano incroci di razze T0xT1 isolati da diversi ospiti (un basso numero di oospore in via di sviluppo e germinate, un'alta percentuale di oospore abortive e sottosviluppate) ... L'efficienza degli incroci tra isolati della razza T0 isolati dalle patate era intermedia. Poiché il corpo principale dei ceppi della razza T0 colpisce le patate, ha una fonte affidabile di svernamento: i tuberi di patata, per cui l'importanza delle oospore come unità infettive svernanti per le popolazioni di patate è bassa. La “forma di pomodoro” adattata è in grado di svernare sul pomodoro sotto forma di oospore (vedi sotto) e quindi mantiene una maggiore produttività del processo sessuale. A causa della sua elevata fertilità, T1 acquisisce un potenziale indipendente di infezione primaria nel pomodoro. I risultati ottenuti da Knapova et al. (Knapova et al., 2002) possono essere interpretati allo stesso modo. Incroci di ceppi isolati da patate con ceppi di pomodoro hanno dato il maggior numero di oospore - 13,8 per mq. medio (con uno spread di 5-19) e una percentuale intermedia di germinazione delle oospore (6,3 con uno spread di 0-24). Gli incroci di ceppi isolati dal pomodoro hanno prodotto la percentuale più bassa di oospore (7,6 con uno spread di 4-12) con la percentuale più alta della loro germinazione (10,8). Gli incroci tra i ceppi isolati dalle patate hanno dato un numero intermedio di oospore (8,6 con un'elevata dispersione di dati - 0-30) e la percentuale più bassa di germinazione di oospore (2,7). Pertanto, i ceppi di patate sono meno fertili di quelli di pomodoro, ma gli incroci di interpopolazione non hanno dato risultati peggiori di quelli di intrapopolazione. È possibile che le differenze con i dati di cui sopra di Bagirova et al. sono spiegati dal fatto che i ricercatori russi hanno lavorato con ceppi isolati all'inizio degli anni '90 del 90 ° secolo e i ricercatori svizzeri - con ceppi isolati alla fine degli anni 'XNUMX.
La base per la bassa fertilità può essere l'eteroploidia dei ceppi. Se nelle popolazioni messicane, dove il processo sessuale e l'infezione primaria da progenie oospore sono regolari, la maggior parte dei ceppi studiati di P. Infestans sono diploidi, allora nei paesi del Vecchio Mondo si osserva il polimorfismo di intrapopolazione della ploidia (ceppi di-, tri- e tetraploidi, nonché ceppi eterocariotici con nuclei eteroploidi) e ceppi con diversi tipi di accoppiamento, ad es. reciprocamente fertili, differiscono nella ploidia nucleare (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). La diversità dei nuclei in antheridia e oogonia può essere la ragione della bassa fertilità.
Per quanto riguarda gli scambi nucleari tra ife durante le anastomosi, ciò è prevenuto dall'incompatibilità vegetativa, che scompone le popolazioni asessuate in molti cloni geneticamente isolati (Poedinok e Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Convergenza delle popolazioni. I dati sopra riportati indicano che è possibile l'ibridazione tra ceppi di P. infestans "patata" e "pomodoro". È anche possibile la reinfezione reciproca di diversi ospiti, sebbene con ridotta aggressività.
Uno studio sui marcatori di popolazione in isolati da campi adiacenti di patate e pomodori nel 1993 ha mostrato che circa un quarto degli isolati isolati dalle foglie di pomodoro sono stati trasferiti da un campo di patate vicino (Dolgova et al., 1997). Teoricamente, si potrebbe presumere che la divergenza delle popolazioni su due ospiti aumenterebbe e porterebbe alla comparsa di forme intraspecifiche specializzate (f.sp. patata e f.sp. pomodoro), soprattutto perché le oospore possono persistere nei detriti vegetali (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) e semi di pomodoro (Rubin et al., 2001). Di conseguenza, i pomodori hanno attualmente una fonte di rigenerazione primaverile indipendente dai tuberi di patata.
Tuttavia, tutto è andato diversamente. Lo svernamento con oospore ha permesso al parassita di evitare la fase più ristretta del suo ciclo vitale - la fase monociclica della vegetazione nel suolo, durante la quale diminuiscono le proprietà parassitarie, che vengono gradualmente ripristinate nella fase policiclica in estate.
Tabella 11. Frequenze dei geni di virulenza nelle varietà differenzianti di patate nei ceppi di P. infestans
paese | anno | Numero medio di geni di virulenza nei ceppi | autore | |
dalle patate | dal pomodoro | |||
Francia | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francia, Svizzera | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Stati Uniti | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israele | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Russia, Mosk. regione | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Russia, diverse regioni | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya e altri. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Le zoosporangie primarie e le zoospore, che germinano oospore, hanno un alto grado di attività parassitaria, specialmente se le oospore si sono formate partenogeneticamente sotto l'influenza di feromoni di un ceppo con il tipo opposto di accoppiamento. Pertanto, il materiale infettivo sulle piantine di pomodoro coltivate da semi infettati da oospore è altamente patogeno sia per il pomodoro che per la patata.
Questi cambiamenti hanno portato ad un'altra ristrutturazione della popolazione, espressa nei seguenti importanti cambiamenti dal punto di vista epidemiologico:
- Le piantine di pomodoro infette sono diventate un'importante fonte di infezione primaria delle patate (Filippov, Ivanyuk, messaggi personali).
- Le epifitosi sulle patate hanno cominciato a essere osservate già a giugno, circa un mese prima del solito.
- Nelle piantagioni di patate, è aumentata la percentuale della razza T1, che in precedenza si trovava in una quantità insignificante (Ulanova et al., 2003).
- I ceppi isolati dalle foglie di pomodoro non differivano più dai ceppi di patata in virulenza sui differenziatori dei geni di virulenza della patata e hanno iniziato a superare i ceppi di “patata” in termini di aggressività non solo sul pomodoro ma anche sulle patate (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Quindi, invece della divergenza, c'è stata una convergenza di popolazioni, l'emergere di una singola popolazione su due piante ospiti con alta virulenza e aggressività per entrambe le specie.
conclusione
Quindi, nonostante più di 150 anni di studio intensivo di P. infestans, in biologia, inclusa la biologia della popolazione di questo agente eziologico delle più importanti malattie delle piante solanacee coltivate, molto rimane sconosciuto. Non è chiaro come il passaggio delle singole fasi del ciclo vitale influenzi la struttura delle popolazioni, quali siano i meccanismi genetici della variabilità canalizzata di aggressività e virulenza, qual è il rapporto tra i sistemi riproduttivo e riproduttivo clonale nelle popolazioni naturali, come si eredita l'incompatibilità vegetativa, qual è il ruolo di patate e pomodori nell'infezione primaria di queste colture e in qual è il loro effetto sulla struttura della popolazione del parassita. Finora non sono state risolte importanti questioni pratiche come i meccanismi genetici per modificare l'aggressività del parassita o l'erosione della resistenza aspecifica della patata. Con l'approfondimento e l'espansione della ricerca sulla peronospora della patata, il parassita pone nuove sfide ai ricercatori. Tuttavia, il miglioramento delle capacità sperimentali, l'emergere di nuovi approcci metodologici alla manipolazione con geni e proteine ci permettono di sperare in una soluzione di successo delle domande poste.
L'articolo è stato pubblicato sulla rivista "Potato Protection" (n. 3, 2017)