D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Il fungo fitopatogeno Colletotrichum coccodes causa pericolose malattie nelle patate e nei pomodori note come antracnosi e macchia nera del tubero. Per caratteristiche morfologiche, sono spesso difficili da distinguere dalle malattie causate da altri microrganismi; sui frutti di pomodoro verde, la malattia può essere asintomatica, manifestandosi solo sui frutti rossi maturi. Per una diagnosi rapida e accurata dell'agente patogeno, viene offerto un sistema di test PCR in tempo reale. Per sviluppare un sistema di test, è stata determinata la sequenza nucleotidica del gene glicerolo trifosfato deidrogenasi di ceppi di 45 C. coccodes isolati da tuberi di patata in diverse regioni della Russia.
Sulla base dei risultati ottenuti e dell'analisi di sequenze simili di altre specie disponibili nel database GenBank, sono stati progettati primer specie-specifici e sonda per C. coccodes. Per verificare la specificità del sistema di test creato, è stata eseguita la PCR con DNA isolato da colture pure di 15 diverse specie di funghi parassiti e saprotrofi associati a piante di pomodoro e patata (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). La presenza del DNA di Colletotrichum coccodes è stata determinata a un ciclo soglia di 20-27, mentre altre specie sono state rilevate dopo 40 cicli o non sono state rilevate. Il sistema di analisi consente di rilevare in modo affidabile concentrazioni di DNA di C. coccodes superiori a 0.01 ng / mm3 nella miscela PCR analizzata. Utilizzando il sistema di test sviluppato, è stata studiata la presenza di C. coccodes nelle foglie di pomodoro con sintomi di malattie fungine e nei tuberi di patata senza sintomi esterni della malattia. Le foglie con sintomi di infezione fungina sono state raccolte da due diversi campi nel territorio di Krasnodar, tuberi - dai campi nelle regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga, Nizhny Novgorod. Una foglia di pomodoro contenente DNA di C. coccodes è stata trovata nel territorio di Krasnodar; una presenza significativa di DNA di questo patogeno è stata rilevata in 5 campioni di tuberi coltivati nelle regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga.
Introduzione
I funghi del genere Colletotrichum sono fitopatogeni pericolosi che colpiscono i cereali, le verdure, le erbe, i frutti perenni e le piante di bacche. Una delle specie onnipresenti di questo genere, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, è l'agente eziologico dell'antracnosi e della macchia nera di patate e pomodori, e causa malattie di un certo numero di altre piante della famiglia delle Solanacee, incl. erbacce (Dillard, 1992). C. coccodes colpisce tutte le parti sotterranee della pianta, basi del fusto, foglie e frutti (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Sulla buccia dei tuberi di patata infetti si osserva lo sviluppo di macchie grigie con bordi indistintamente pronunciati, su cui sono chiaramente visibili punti neri di sporulazione e microsclerotia. Durante la conservazione, ulcere con contenuto ammorbidito possono formarsi nella polpa dei tuberi, ad es. la malattia entra nella fase antracnosi, che però è estremamente rara.
Allo stesso tempo, i sintomi dell'antracnosi (ulcere cutanee con piccoli punti neri) sono tipici dei frutti di pomodoro. Sulle foglie, i sintomi di C. coccodes appaiono come macchie marrone scuro, solitamente delimitate da tessuto giallo (Johnson, 1994).
Lo sviluppo della macchia nera sui tuberi rovina il loro aspetto, il che è particolarmente pronunciato quando si vendono patate a buccia rossa lavate. L'esfoliazione con buccia porta ad un'evaporazione eccessiva e ad un aumento delle perdite di stoccaggio (Hunger, McIntyre, 1979). Il danno ad altri organi della pianta porta a perdite di rendimento, che è stato notato sia in terreno aperto che chiuso (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Le malattie causate da C. coccodes sono comuni in quasi tutte le regioni produttrici di patate del mondo, inclusa la Russia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Il controllo di queste malattie è difficile a causa dell'insufficiente efficacia dei fungicidi esistenti contro C. coccodes e della mancanza di varietà resistenti (Read, Hide, 1995).
L'inoculo di C. coccodes può persistere nei tuberi da seme (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), nei semi di pomodoro (Ben-Daniel et al., 2010), sopravvivere a lungo nel suolo, sui detriti vegetali (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) e nelle erbacce (Raid, Pennypacker, 1987). I lavori di una serie di autori (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) hanno dimostrato che lo sviluppo della malattia nelle patate e nei pomodori dipende in gran parte dalla presenza di inoculo nei semi e suolo. Pertanto, per ridurre al minimo le perdite dalla malattia, è necessario diagnosticare (anche quantitativamente) i propaguli del fungo nel materiale del seme, nel terreno, nei tuberi di patata da seme e nei semi di pomodoro posti per la conservazione. La diagnostica morfologica del suolo e del materiale vegetale può essere effettuata solo dalla presenza di microsclerotia, che però si ritrovano anche in altri tipi di funghi.
I sintomi sui tuberi sono molto simili alla crosta argentea causata dal fungo Helminthosporium solani. L'isolamento di Colletotrichum coccodes e Helminthosporium solani in una coltura pura è piuttosto difficile e richiede molto tempo a causa della lenta crescita su un mezzo nutritivo. Per identificare rapidamente i coccodi di Colletotrichum, è necessario utilizzare metodi diagnostici strumentali. Il metodo più conveniente è la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la sua modifica - PCR in tempo reale. Attualmente, un sistema di test sviluppato da ricercatori britannici (Cullen et al., 2002) per la regione ITS1 dell'rDNA viene utilizzato in Europa e negli Stati Uniti. Il suo utilizzo ha mostrato buoni risultati nell'analisi degli isolati russi (Belov et al, 2018). Tuttavia, C. coccodes è altamente variabile e la sua rilevazione da una singola sequenza di DNA può portare a risultati falsi negativi. Per una diagnosi più affidabile, è necessaria l'analisi per diverse sequenze di DNA specie-specifiche, in relazione alle quali abbiamo sviluppato un sistema di test originale che consente di identificare C. coccodes dalla sequenza del gene della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi.
Materiali e metodi
Per valutare l'efficacia e la specificità dei sistemi di test creati, abbiamo utilizzato colture pure di 15 specie di funghi, isolate dagli autori dai campioni interessati di foglie e frutti di pomodoro, tuberi di patata (Tabella 1). Per l'isolamento, abbiamo prelevato organi di piante con sintomi di infezione fungina, non più di un organo per cespuglio.
Una fetta di un tubero con una buccia, una fetta di un frutto di pomodoro e una foglia colpita sono state poste sotto un microscopio binoculare, dopo di che micelio, spore o un pezzo di tessuto sono stati trasferiti su un mezzo agar (agar di mosto) in una capsula di Petri con un ago da dissezione affilato. Gli isolati sono stati conservati su agar inclinato in provette a 4 ° C.
Campioni di foglie di pomodoro per analisi con sintomi di malattie fungine subito dopo la raccolta (in campo) sono stati posti in alcool etilico al 70% in cui sono stati conservati fino all'isolamento del DNA. I tuberi di patata sono stati consegnati al laboratorio, pelati (pezzo 2 × 1 cm) e congelati a –20 ° С. Conservato congelato fino all'isolamento del DNA.
Colture pure di funghi per l'isolamento del DNA sono state coltivate in mezzo di pisello liquido. Il micelio del fungo è stato rimosso dal mezzo liquido, essiccato su carta da filtro, congelato in azoto liquido, omogeneizzato, incubato in tampone CTAB, purificato con cloroformio, precipitato con una miscela di isopropanolo e acetato di potassio 0.5 M, lavato due volte con alcol al 2%. Il DNA risultante è stato sciolto in acqua deionizzata e conservato a –70 ° С (Kutuzova et al., 20). La concentrazione di DNA è stata misurata utilizzando un kit di quantificazione del DNA HS per DNA a doppia elica su Qubit 2017 (Qiagen, Germania). I campioni alcolizzati e congelati sono stati triturati in azoto liquido, quindi l'estrazione del DNA è stata eseguita come descritto sopra (per il micelio di colture fungine pure).
Tabella 1. Origine dei ceppi di funghi utilizzati
Nome del fungo | Pianta, organo | Luogo di selezione |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyoectria crassa, Rhizoctonia solani | tubero di patata | Regione di Kostroma, tuberi di patata della 1a generazione di campo, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum coccodi 4 | foglia di patata | Rappresentante. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubero di patata | Regione di Magadan, pos. Tenda, tubero di patata |
Cladosporium fulvo | foglia di pomodoro | Regione di Mosca, pomodoro a frutto grosso |
Alternaria pomodorofila | frutto di pomodoro | consegnato dal personale del laboratorio di micologia e fitopatologia dell'Istituto di ricerca russo per la protezione delle piante |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | frutto di pomodoro | Territorio di Krasnodar, distretto di Krymsky, grado Cream |
Fusarium oxysporum | radice di grano | regione di Mosca. |
La PCR è stata eseguita su un amplificatore DTprime (DNA-Technology). Per la PCR sono stati utilizzati primer originali e una sonda per la regione specie-specifica del gene glicerolo trifosfato deidrogenasi: primer diretto Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, primer inverso Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). I primer amplificano una regione di 213 bp.
La reazione ha richiesto 50 ng di DNA totale (nell'analisi di foglie e tuberi) e 10 ng (nell'analisi del DNA di colture pure di funghi). La miscela di reazione (35 μl) è stata separata da uno strato di paraffina in due parti: quella inferiore (20 μl) conteneva 2 μl di tampone di reazione 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM di ciascun deossinucleotide trifosfato, 7 pmol di ciascun primer e 4 pmol di una sonda fluorescente idrolizzabile; quello superiore conteneva 1 μl di tampone 10 × PCR e 1 U di Taq polimerasi.
La separazione della miscela con paraffina consente di conservare a lungo le provette a una temperatura di 5 ° C e di fornire un avvio a caldo per la PCR dopo averle riscaldate per 10 min a una temperatura superiore a 80 ° C. La PCR è stata eseguita secondo il seguente programma: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclo); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cicli); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cicli); 10.0 ° C - conservazione.
risultati e discussione
Le sequenze del gene della glicerina trifosfato deidrogenasi sono state determinate in 45 ceppi isolati da foglie, steli, tuberi di patata e frutti di pomodoro (Kutuzova, 2018) in diverse regioni della Russia. Le sequenze studiate di tutti i ceppi sono state divise in 2 gruppi che differivano per due nucleotidi. Le sequenze nucleotidiche dei rappresentanti di entrambi i gruppi con i numeri KY496634 e KY496635 sono depositate in GenBank.
I primer coc70gdf, coc280gdr e la sonda cocgdz progettati sulla loro base sono stati controllati utilizzando il programma BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) su tutte le sequenze del gene della glicerina trifosfato deidrogenasi di specie del genere Colletotrichum e altri organismi disponibili nella banca dati GenBank.
Non sono state trovate regioni di DNA di altri organismi altamente omologhi ai primer e alla sonda.
La sensibilità del sistema di test è stata verificata utilizzando campioni con diverse concentrazioni di DNA di C. coccodes, DNA di una foglia di patata infettata da antracnosi (raccolto nel 2017 a Mari El, varietà Red Scarlett) e buccia di tuberi affetti da macchia nera (raccolta nella regione di Kostroma, varietà Red Scarlett, tabella 2). Per confermare la presenza di DNA nei tuberi e nelle foglie di patata, i ceppi di C. coccodes sono stati isolati da essi in colture pure.
I risultati dell'analisi di sensibilità del sistema di test mostrano che può essere utilizzato per diagnosticare con successo la presenza di DNA di C. coccodes in un campione quando il suo contenuto totale nella miscela PCR è superiore a 0.05 ng. Questo è abbastanza sufficiente per il rilevamento, poiché uno sclerozio contiene, in media, 0.131 ng e una spora contiene circa 0.04 ng di DNA (Cullen et al., 2002). Il sistema di test sviluppato dal gruppo inglese (Cullen et al., 2002) ha mostrato una sensibilità simile (ciclo soglia 34 a 0.05 ng di DNA e 37 a 0.005 ng).
L'analisi di campioni naturali contenenti C. coccodes in tutti i casi ha permesso di rivelare in modo affidabile la sua presenza nel campione (Tabella 2). Il metodo proposto per l'isolamento del DNA era applicabile anche per l'analisi di campioni di piante naturali.
Tabella 2. Determinazione della sensibilità del sistema di test proposto per l'identificazione di Colletotrichum coccodes per la PCR in tempo reale
campione | Quantità di DNA nel campione *, ng | Ciclo di soglia | Rilevazione di C. coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Buccia di tubero 1 | 50 | 32 | + |
Buccia di tubero 2 | 50 | 30 | + |
Buccia di tubero 3 | 50 | 31.5 | + |
Foglia di patata | 50 | 29.5 | + |
Nota. * In una miscela di prodotti PCR.
La specificità del sistema di test è stata testata su campioni di DNA estratti da 15 specie di funghi. Tutti i ceppi di funghi sono stati isolati dagli autori da frutti sani e affetti e foglie di pomodoro, tuberi di patata; un ceppo è stato isolato dalla radice di grano (Tabella 1). Tra le specie isolate dalla superficie del frutto ci sono anche specie non patogene per il pomodoro (ad esempio Phellinus ferrugineovelutinus).
Gli studi hanno dimostrato che il DNA di C. coccodes è stato rilevato a un ciclo soglia di 20-27, mentre altre specie fungine non sono state rilevate o hanno dato un segnale dopo il ciclo 40, che può essere attribuito a un effetto di rumore non specifico (Tabella 3).
Tabella 3. Controllo del sistema di test per vari tipi di funghi
Nome del fungo | Ciclo di soglia |
Coccodi del Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. coccodi 2 | 22.6 |
C. coccodi 3 | 23 |
C. coccodi 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis fasioli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. pomodorofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vescicarium | > 40 |
Ilionectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvo | > 40 |
Acrodonium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Nota. * La quantità di DNA in tutti i campioni era di 10 ng.
Il sistema di test sviluppato è stato utilizzato per identificare C. coccodes in campioni di foglie di pomodoro con sintomi di patogeni necrotrofi e tuberi di patata da seme senza sintomi visibili. Per lo studio, abbiamo preso tuberi da seme di diverse varietà coltivate nelle regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga, Nizhny Novgorod. La presenza di DNA di C. coccodes è stata considerata significativa nei campioni, nelle cui analisi il ciclo soglia non ha superato 35. Questo valore di soglia è stato selezionato in base alla determinazione affidabile di 0.05 ng di DNA di C. coccodes (ciclo soglia 33.5, Tabella 2) e a cicli soglia superiori a 40, è stato diagnosticato DNA non specifico di alcune altre specie fungine. Con questo approccio, è stata rilevata una presenza significativa di DNA di C. coccodes in 5 campioni di tuberi coltivati nelle regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga e in una foglia di pomodoro del distretto di Yeisk della regione di Krasnodar (Tabelle 4, 5).
Tabella 4. Rilevazione di Colletotrichum coccodes sui tuberi di patata *
Numero campione | Varietà di patate | Luogo di crescita | Rilevazione di C. coccodes | Ciclo di soglia |
---|---|---|---|---|
1 | Rosso scarlatto | Regione di Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | regione di Mosca. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky presto | regione di Mosca. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Молли | Regione di Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasia | Regione di Kaluga | - | |
15 | gala | regione di Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * La quantità di DNA in tutti i campioni era di 50 ng.
Tabella 5. Rilevazione di Colletotrichum coccodes su foglie di pomodoro *
Numero campione | Luogo di crescita | Rilevazione di C. coccodes | Ciclo di soglia |
---|---|---|---|
1 | Territorio di Krasnodar, distretto della Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Territorio di Krasnodar, distretto di Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* La quantità di DNA in tutti i campioni era di 50 ng.
Il sistema di test da noi creato non è inferiore a quello sviluppato dai ricercatori britannici (Cullen et al., 2002) per sensibilità e specificità ed è adatto per l'analisi di campioni vegetali. La sua applicazione per l'analisi dei tuberi da seme ha permesso di identificare il DNA di C. coccodes nei tuberi senza segni esterni di danneggiamento e di analizzare con successo l'infezione delle foglie.
Ad oggi, in Russia non è stata effettuata alcuna analisi dei tuberi di patata per l'infestazione da C. coccodes. Il nostro primo studio ha mostrato che su 16 tuberi da seme testati coltivati in diverse regioni della Federazione Russa, 5 contengono C. coccodes. Ciò dimostra che la macchia nera dei tuberi di patata è una malattia comune della patata in Russia e il suo ruolo nel ridurre il volume e la qualità del raccolto di patate è sottovalutato.
L'analisi delle foglie di pomodoro ha rivelato una presenza significativa di DNA di C. coccodes in una foglia del distretto di Yeisk nel territorio di Krasnodar. In precedenza, durante l'esame dei campi di pomodori nella Russia meridionale utilizzando il sistema di test britannico (Cullen et al., 2002), sono state trovate foglie contenenti C. coccodes e in alcuni campi è stata trovata un'elevata percentuale di foglie infette da C. coccodes (Belov et al., 2018). Nei territori di Krasnodar e Primorsky, la regione di Mosca, abbiamo trovato frutti di pomodoro, dai quali siamo riusciti a isolare colture pure di C. coccodes. È possibile che C. coccodes sia molto più diffuso sul pomodoro in Russia di quanto si creda, e anche la sua nocività è sottovalutata.
Pertanto, ad oggi, sono state accumulate sufficienti informazioni sulla distribuzione capillare di C. coccodes su patate e pomodori.
Per comprendere meglio il ruolo di questo fungo nello sviluppo delle malattie della patata e del pomodoro, è necessario monitorarne la prevalenza in Russia, studiare il ruolo delle infezioni del suolo e dei semi e il ruolo della macchia nera nelle perdite durante lo stoccaggio. L'uso della diagnostica PCR può facilitare notevolmente questo lavoro e l'uso simultaneo di entrambi i sistemi di test aumenterà significativamente l'accuratezza dell'analisi.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Russian Science Foundation n. 18-76-00009.
L'articolo è stato pubblicato sulla rivista "Mycology and Phytopathology" (volume 54, n. 1, 2020).