Caratteristiche biologiche e resistenza ai fungicidi del fungo fitopatogeno Ilyonectria crassa

MANGIARE. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky

È stato recentemente dimostrato che il fungo ascomiceta Ilyonectria crassa è in grado di infettare i tuberi di patata. Questo lavoro è il primo ad analizzare le caratteristiche biologiche e la resistenza ad alcuni fungicidi del ceppo I. crassa isolato dalle patate. Le sequenze delle regioni specie-specifiche del ceppo “patata” coincidevano con quelle ottenute in precedenza per i funghi isolati dalle radici di narciso, ginseng, pioppo tremulo e faggio, bulbi di giglio e foglie di tulipano. Apparentemente, molte piante selvatiche e da giardino possono essere riserve di I. crassa. Il ceppo esaminato ha infettato fette di pomodoro e patate, ma non ha infettato l'intero frutto del pomodoro e il tubero di patata intatto. Questo dimostra che I. crassa è un parassita della ferita. La valutazione della resistenza a fludioxonil, difenoconazolo e azoxystrobin su un mezzo nutritivo ha mostrato un'elevata efficacia di questi farmaci.

L'indicatore EC50 (la concentrazione del fungicida, che rallenta di 2 volte la velocità di crescita radiale della colonia rispetto al controllo non fungicida) era pari a 0.4; 7.4 e 4 mg / l, rispettivamente. La possibilità dello sviluppo della malattia causata da I. crassa dovrebbe essere presa in considerazione durante la valutazione fitopatologica dei tuberi di patata e lo sviluppo di misure di protezione delle piante.

Lo sviluppo di microrganismi fitopatogeni porta a perdite elevate in tutte le fasi di coltivazione e conservazione delle patate. Quando si pianificano misure protettive, di regola, vengono presi in considerazione patogeni ben noti, come le specie dei generi Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, ecc. Tuttavia, negli ultimi anni, sono apparse sempre più segnalazioni sulla comparsa di nuovi microrganismi fitopatogeni sulle patate. La loro biologia è scarsamente studiata, l'efficacia dei fungicidi utilizzati sulle patate in relazione ad esse è sconosciuta, i metodi diagnostici non sono stati sviluppati. Con uno sviluppo massiccio, sono in grado di causare danni significativi al raccolto di patate. Uno di questi microrganismi è il fungo ascomiceta Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, scoperto per la prima volta dagli autori sui tuberi di patata (Chudinova et al., 2019).

Questo lavoro presenta i risultati dell'analisi del ceppo I. crassa isolato dai tuberi di patata. Sono state studiate la morfologia delle colonie e delle strutture miceliali di I. crassa, sequenze nucleotidiche di regioni del DNA specie-specifiche, virulenza a patate e pomodori e resistenza ad alcuni fungicidi popolari.

Materiali e metodi

Abbiamo utilizzato il ceppo I. crassa 18KSuPT2 isolato nel 2018 dal tubero di patata infetto coltivato nella regione di Kostroma. Il tubero era affetto da un tipo di marciume secco con una cavità ricoperta di micelio marrone chiaro. Utilizzando un ago da dissezione sterile, il micelio fungino è stato trasferito in una capsula di Petri con un mezzo agar (mosto di birra 10%, agar 1.5%, penicillina 1000 U / ml). Le piastre sono state incubate al buio a 24 ° C.

Un microscopio ottico Leica DM2500 con una fotocamera digitale ICC50 HD e un microscopio binoculare Leica M80 con una fotocamera digitale IC80HD (Leica Microsystems, Germania) sono stati utilizzati per fotografare, valutare le dimensioni e la morfologia delle spore e degli organi spore.

Per isolare il DNA, il micelio fungino è stato coltivato in mezzo di pisello liquido, quindi congelato in azoto liquido, omogeneizzato, incubato in tampone CTAB, purificato con cloroformio e lavato due volte con alcol al 2%.

Il metodo di estrazione del DNA è descritto in dettaglio nell'articolo di Kutuzova et al. (2017).

Per determinare la specie con metodi molecolari e confrontarla con altri ceppi noti di I. crassa, la PCR è stata eseguita con primer che consentivano l'amplificazione di regioni del DNA specie-specifiche: ITS1-5,8S-ITS2 (primer ITS5 / ITS4, White et al., 1990), regioni del gene b -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) e fattore di allungamento di traslazione 1α (tef1α) (primer EF1-728F / EF1-986R, Carbone e Kohn, 1999). Gli ampliconi della lunghezza desiderata sono stati estratti dal gel utilizzando il kit Evrogen CleanUp. Le regioni amplificate sono state sequenziate utilizzando il BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) su un sequencer automatizzato Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Le sequenze nucleotidiche ottenute sono state utilizzate per cercare una corrispondenza nel database GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) degli Stati Uniti. L'analisi filogenetica è stata eseguita utilizzando il programma MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

La determinazione della virulenza è stata effettuata su frutti verdi interi di pomodoro a frutto grosso (varietà Dubrava) e tuberi di patata (varietà Gala). Inoltre, per simulare danni a frutti e tuberi danneggiati, abbiamo utilizzato fette degli stessi frutti e tuberi. Fette di tuberi sono state poste in camere umide, che erano piastre di Petri con carta da filtro bagnata sul fondo. Sulla carta è stata posizionata una diapositiva, sulla quale sono state posizionate a loro volta fette di tuberi o frutti. Tuberi e frutti interi sono stati anche posti in contenitori con carta da filtro bagnata sul fondo. Al centro della fetta (o sulla superficie intatta del tubero o del frutto), un pezzo di agar (5 × 5 mm) con ife fungine è stato posto dopo 5 giorni di crescita su agar di mosto.

La valutazione della resistenza dei ceppi fungini ai fungicidi è stata effettuata in condizioni di laboratorio su terreno nutritivo agar. Abbiamo studiato la suscettibilità ai farmaci fungicidi Maxim, KS (principio attivo fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazolo 250 g / l) (State catalog ..., 2020). La valutazione è stata effettuata in piastre Petri su terreno mosto-agar con l'aggiunta dei farmaci studiati a concentrazioni della sostanza attiva 0.1; uno; 1 ppm (mg / L) (per fludioxonil e difenoconazolo), 10; dieci; 1 ppm (per azoxystrobin) e in terreni senza fungicida (controllo). Il fungicida è stato aggiunto al mezzo fuso e raffreddato a 10 ° C, dopodiché il mezzo è stato versato in piastre Petri. Un blocco di agar con micelio fungino è stato posto al centro di una capsula di Petri e coltivato a una temperatura di 100 ° C al buio. Dopo 60 giorni di incubazione, i diametri delle colonie sono stati misurati in due direzioni reciprocamente perpendicolari; i risultati delle misurazioni per ciascuna colonia sono stati mediati. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. Sulla base dei risultati delle analisi è stato calcolato l'EC24, pari alla concentrazione del fungicida, che ha dimezzato la velocità di crescita radiale della colonia rispetto al controllo fungicida.

risultati e discussione

Su piastre di Petri con agar di mosto, il fungo formava colonie con micelio flocculante bianco. Il mezzo sotto il micelio è diventato rosso-marrone. Quando il terreno si asciuga, il fungo forma spore di due tipi su conidiofori singoli e aggregati in piccoli sporodochia. I macroconidi sono allungati, cilindrici, da uno a tre setti, lunghezza media 27.2 µm con un range di valori da 23.2 a 32.2 µm, larghezza - fino a 4.9 µm (Fig. 1). La lunghezza media dei microconidi è di 14.3 µm con un range di valori da 10.3 a 18.1 µm, la larghezza è fino a 4.0 µm. Tutti i caratteri macro e micromorfologici rientrano nella gamma di variazione della specie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).

Le sequenze delle regioni del DNA specie-specifiche (ITS, b-tubulina, TEF 1α) coincidevano completamente con le sequenze dei ceppi di I. crassa che abbiamo studiato in precedenza (Chudinova et al., 2019, Tabella 1). Al fine di studiare la prevalenza di I. crassa in altre regioni e analizzare lo spettro delle colture colpite, sono state analizzate sequenze di DNA simili nel database GenBank (Tabella 1). La sovrapposizione era dall'86 al 100%. Le sequenze di tutte e tre le regioni del DNA del ceppo I. crassa della “patata” erano identiche alle sequenze dei ceppi isolati dal bulbo di giglio e dalle radici del narciso nei Paesi Bassi e dalla radice di ginseng in Canada. Non siamo riusciti a trovare altri ceppi di I. crassa con tre sequenze simili analizzate in database aperti. Tuttavia, l'analisi delle sequenze ITS e b-tubulina depositate ha mostrato la presenza di I. crassa sulle foglie di tulipano nel Regno Unito. Funghi con una sequenza ITS simile sono stati identificati nell'analisi del micobiota delle radici di pioppo in Canada e delle radici di faggio in Italia, tuberi di patata in Arabia Saudita (Tabella 1). I risultati di questo studio mostrano che I. crassa ha una distribuzione globale ed è in grado di infettare varie specie di piante.

Nel determinare la patogenicità su fette di pomodoro e patata il 5 ° giorno, il diametro della lesione ha raggiunto 1.5 cm Il ceppo studiato non ha infettato l'intero frutto del pomodoro e il tubero di patata intatto. Tuttavia, i sepali sono stati colpiti sul pomodoro. Per escludere la possibilità di contaminazione, un isolato fungino dal micelio sviluppato su una fetta di tubero di patata è stato isolato in una coltura pura. Era completamente identico al ceppo parentale. A quanto pare, I. crassa è un parassita della ferita.

Il trattamento pre-impianto di tuberi da seme con fungicidi riduce lo sviluppo di malattie sulle piante durante la stagione di crescita. Per la selezione di fungicidi efficaci, è importante valutare quali di essi sono efficaci contro I. сrassa. Il lavoro ha studiato le sostanze attive diffuse dei fungicidi: fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazolo. Fludioxonil è incluso in diverse miscele utilizzate per condire semi e tuberi da seme prima della semina. Fludioxonil (Maxim) è anche usato per trattare i tuberi da seme prima della conservazione. Il difenoconazolo e l'azossistrobina sono anche inclusi in una serie di preparati utilizzati per la lavorazione del materiale dei semi, nonché in preparati destinati alla lavorazione delle piante vegetative (Catalogo di stato ..., 2020).

Il tasso di crescita di I. crassa è stato studiato su terreni (Fig.2) con diverse concentrazioni di principi attivi: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) e difenoconazolo (EC50 = 7.4 ppm) (Tabella 2). Questi preparati possono essere considerati altamente efficaci contro I. crassa, poiché la loro EC50 è significativamente inferiore alla concentrazione raccomandata del preparato nel fluido di lavoro utilizzato per il trattamento dei tuberi. Secondo il Catalogo di Stato ... (2020), la concentrazione di fludioxonil nel liquido per il trattamento dei tuberi di patata è compresa tra 500 e 1000 ppm, azoxystrobin (nel liquido per il trattamento del fondo del solco) - 3750-9375 ppm, difenoconazolo (nel liquido per il trattamento delle piante vegetative) - 187.5– 625 ppm.

Tabella 1. Somiglianza di sequenza delle sequenze specie-specifiche dei ceppi 18KSuPT2 e Ilyonectria crassa disponibili nel database Genbank

ND = non depositato

Tabella 2. Resistenza di Ilyonectria crassa ai fungicidi

Nel nostro lavoro, i ceppi di I. crassa sono stati isolati da tuberi di patata nelle regioni di Kostroma e Mosca (Chudinova et al., 2019). Un'alta percentuale di ceppi fungini con sequenze ITS identiche a I. crassa è stata rilevata durante l'analisi del mycobiota dei tuberi di patata in Arabia Saudita (Gashgari e Gherbawy, 2013). A quanto pare, I. crassa non è così raro sulle patate come potrebbe sembrare. I nostri esperimenti hanno dimostrato che il fungo potrebbe infettare i frutti di pomodoro danneggiati. È noto dalla letteratura che I. crassa è in grado di svilupparsi nel suolo in modo saprotrofico (Moll et al., 2016), nonché di colpire una varietà di piante, anche tassonomicamente distanti come narcisi, gigli, ginseng, pioppo tremulo e faggio (Tabella 1). uno). Apparentemente, molte piante selvatiche e da giardino possono essere riserve di I. crassa. Quanto sopra mostra che quando si sviluppano misure di protezione, è necessario tenere conto della possibilità di influenzare i tuberi di patata con questo fungo. Preparazioni diffuse per il trattamento dei tuberi di patata contenenti fludioxonil, azoxystrobin e difenoconazolo hanno mostrato un'elevata efficacia fungicida contro I. crassa.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione russa per la ricerca di base (sovvenzione n. 20-016-00139).

L'articolo è stato pubblicato sulla rivista "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)